越鞠甘麦大枣汤在中医治疗郁证的临床运用中取得了很好的疗效，且毒副作用小^[1]。前期实验发现，越鞠甘麦大枣汤能够快速修复抑郁小鼠的失乐状态^[2]，其作用机制可能与上调Akt/mTOR信号通路，提高突触可塑性，以及促进神经元再生有关^[3]。本研究拟采用过氧化氢(H₂O₂)诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22氧化损伤模型^[4-5]，探究越鞠甘麦大枣汤的保护作用，有助于指导该方的临床应用。

1 材料 1.1 实验动物

7 ~ 8周龄ICR小鼠，♂，体质量20~22 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：SCXK(苏)2014-0002。

1.2 药物

实验用中药材均购于南京中医药大学国医堂门诊。越鞠甘麦大枣汤由苍术100 g、香附100 g、神曲100 g、栀子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麦250 g、大枣375 g组成，上述药物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h后过滤，再加6倍量水，按上法煎煮后过滤，合并两次药液，于65 ℃减压旋蒸浓缩，浓缩后的药物浓度为8.3 g·kg^-1。

1.3 试剂

DMEM培养液(HyClone公司); 胎牛血清(Gibco公司); 胰酶细胞消化液(含酚红)(碧云天公司); MTT(Solarbio公司); H₂O₂(致远化学制剂有限公司); 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA试剂盒，均购于南京金益柏生物科技公司。

2 方法 2.1 越鞠甘麦大枣汤含药血清的制备

小鼠按10 mL·kg^-1的剂量灌胃给药，每日2次，连续3 d，最后1次灌胃后1 h眼球采血，分离血清，于56 ℃、30 min灭活后过滤除菌，备用。

2.2 MTT法检测HT22细胞的存活率

细胞呈对数生长期时，以6×10⁷·L^-1的密度接种培养，18 h后加入H₂O₂(400、600、800、1 000 μmol·L^-1)，处理1 h后，加20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，492 nm处检测OD值。给药组在H₂O₂造模后，给予越鞠甘麦大枣汤血清(1%、5%、10%)，作用24 h后，检测细胞存活率。预给药组加入不同浓度越鞠甘麦大枣汤血清(1%、5%、10%、20%)预处理24 h，再用H₂O₂造模1 h后，检测细胞存活率。

细胞存活率=(造模组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%

2.3 ELISA法测定LDH、MDA、SOD浓度

取各组细胞培养上清及细胞样品，按试剂盒说明书操作，分别测定LDH、MDA和SOD浓度。

2.4 统计学分析

所有数据均用SPSS 19.0统计软件处理，数据均采用x±s表示。组间两两比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

3 结果 3.1 不同浓度H₂O₂对HT22细胞存活率的影响

不同浓度的H₂O₂均可明显降低HT22细胞的存活率(P < 0.01)。并以600 μmol·L^-1(细胞存活率49%)作为后续H₂O₂造模浓度。

3.2 越鞠甘麦大枣汤血清对H₂O₂损伤的HT22细胞存活率的影响

造模后，细胞存活率明显降低(P < 0.01)，5%和10%越鞠甘麦大枣汤血清给药可以明显提高细胞存活率(P < 0.01，P < 0.05)，见Tab 1。

3.3 越鞠甘麦大枣汤血清对H₂O₂损伤的HT22细胞LDH、SOD、MDA的影响

Tab 1结果显示，造模后能明显增加LDH相对漏出量(P < 0.05)，1%、5%、10%越鞠甘麦大枣汤血清给药均能明显降低LDH相对漏出量(P < 0.01)，且5%给药浓度效果最好。造模后SOD活性明显降低(P < 0.01)，5%越鞠甘麦大枣汤血清给药可明显增强SOD活性(P < 0.01)。造模后MDA含量明显提高(P < 0.05)，5%越鞠甘麦大枣汤血清给药能明显降低MDA含量(P < 0.05)。

3.4 预防性给予越鞠甘麦大枣汤血清对H₂O₂损伤的HT22细胞存活率的影响

造模组与越鞠甘麦大枣汤血清预给药组的细胞存活率均明显下降(P < 0.01)，但造模组与预给药组之间差异无显著性(Tab 1)。

4 讨论

本研究观察了越鞠甘麦大枣汤对于小鼠海马神经元细胞系HT22氧化损伤的修复作用，结果证实，越鞠甘麦大枣汤可以降低胞内LDH漏出率和MDA含量，提高SOD活性，而这种作用不具有预防性，提示其修复作用可能与提高抗氧化能力、抑制氧化应激有关，而其内在机制有待进一步研究。