2. 安徽省立医院西区麻醉科,安徽 合肥 230001
2. Dept of Anesthesiology, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China
心肌缺血/再灌注损伤(ischemic reperfusion injury,IRI)是心脏及大血管手术围术期常见并发症,可导致原有心肌损害加重,严重影响术后心脏功能的恢复,对围术期患者的生命安全造成巨大的威胁[1]。如何预防或减轻再灌注损伤,已成为心血管研究领域重要的关注点。心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤可在体外模拟心肌缺血/再灌注过程,有利于直接观察受损心肌细胞的形态及功能的变化,广泛应用于IRI的细胞分子机制研究[2]。
外泌体是近年来发现的一种具有双层膜结构的囊泡样小体,直径为30~100 nm,体内多种细胞均可分泌。外泌体中包含丰富的蛋白质、脂类、miRNA等,是实现细胞间物质交换及信息传递的重要媒介[3]。随着外泌体研究的不断深入,其在心血管疾病发生、发展中的作用日益受到关注。研究发现,不同起源干细胞分泌的外泌体,可以减小心肌梗死面积,抑制心肌细胞的凋亡,促进血管内皮细胞的生成,抑制炎症反应[4]。此外,缺血预处理能增加血液中外泌体的释放,将这些外泌体灌注到大鼠体内,能大大减小心肌梗死的面积,起到心肌保护作用[5]。阿片类物质是缺血预处理发挥心肌保护作用的主要介质之一,已知阿片类药物预处理可模拟缺血预处理,通过激活促生存信号通路,抑制心肌细胞凋亡。吗啡是心脏和大血管手术麻醉中广泛应用的镇痛药,与缺血预处理相比,具有给药方便、无创伤、临床上易于操作等优点。本课题组前期研究表明,吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)可明显减轻心肌缺血后损伤,抑制心肌细胞凋亡[6]。在此基础上,本研究拟进一步探讨MPC诱导释放的大鼠血清外泌体,是否减轻心肌细胞H/R损伤,以期为阿片类药物心肌保护机制研究提供新的思路和靶点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与细胞株健康成年SD大鼠,♂,体质量(250±30)g,由安徽医科大学动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK(皖)2005-001。大鼠H9c2(2-1)胚胎心肌细胞株,购自中科院上海细胞库。
1.1.2 药物与试剂盐酸吗啡注射液1 mL:10 mg(东北制药集团沈阳第一制药厂,批号160707-2);ExoQuickTM Exosome Precipitation Solution、无外泌体血清(美国SBI公司); DME/F-12细胞培养液(美国Hyclone公司); 细胞增殖检验试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)(广州Biosharp公司); 乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); FITC Annexin V凋亡试剂盒(美国BD公司); 兔抗CD63单克隆抗体、鼠抗HSP60单克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术公司); 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠抗体(北京中杉金桥生物技术公司); ECL发光试剂盒(美国Thermo公司); BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)。
1.1.3 仪器生物安全柜(美国Thermo公司); 荧光显微镜(日本Olympus公司); 缺氧小室(加拿大Stem Cell公司); 细胞培养箱(美国Thermo公司); 蛋白电泳仪、Tanon Fine Do X6全自动化学发光图像分析系统(上海Tannon公司); Tecan M 1000酶标仪(德国Tecan公司); Cytomics FC500流式细胞仪(美国Beckman有限公司); 120 kv透射电镜(美国FEI公司)。
1.2 方法 1.2.1 大鼠预处理及血清外泌体提取SD大鼠随机分为MPC组和对照组(CON),每组3只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,经颈外静脉微量泵泵注吗啡(100 μg·kg-1)5 min,间断5 min,3个循环,即为MPC。对照组大鼠麻醉后,泵注等量生理盐水。预处理结束后,收集大鼠血液,采用ExoQuickTM试剂盒提取血清中的外泌体。血清以3 000×g离心15 min去除细胞和细胞碎片,留取上清; 上清经过0.22 μm一次性滤器过滤,所得上清液按照试剂盒说明书,加入沉淀剂,混合均匀后,4 ℃放置30 min; 将孵育好的混合物4 ℃、1 500×g离心30 min,离心后外泌体呈米黄色或白色沉淀沉于管底; 弃上清,再次1 500×g离心5 min,留取沉淀,即为外泌体,用400 μL PBS或DMEM/F12培养液重悬,保存于-80 ℃,分别标记为MPC-Exo和CON-Exo。
1.2.2 BCA蛋白定量将0.5 g·L-1的蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL顺序加到96孔板中,各孔加入PBS补足到20 μL; 上述提取的外泌体样品稀释到合适浓度后,取5 μL加到96孔板中,加PBS补足到20 μL; 各孔加BCA工作液200 μL,用加样枪轻轻吹打混匀; 37 ℃孵育30 min后放入酶标仪,于波长562 nm处测定各孔的吸光度。用测定的外泌体中蛋白浓度表示外泌体浓度。
1.2.3 外泌体的鉴定 1.2.3.1 透射电镜观察形态取5 μL上述提取的外泌体悬液,载样于铜网表面,2.5%戊二醛溶液固定,随后滴加3%磷钨酸室温下负染5 min,用滤纸从铜网侧面吸去多余的负染液,将铜网放在纯水中2 min,洗涤3次,室温干燥,120 kV下观察拍摄电镜图片。
1.2.3.2 Western blot检测外泌体标志蛋白取上述分离得到的外泌体100 μL,加入10 μL RIPA裂解液,冰上裂解20 min,14 000×g离心10 min,收集上清液,BCA法测定蛋白浓度。将蛋白与5×SDS上样缓冲液混匀(体积比4 :1),100 ℃煮10 min。取20 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后,转移至PVDF膜,在含5%脱脂牛奶的TBST封闭液中室温孵育1 h,TBST液漂洗10 min×3次,加入CD63、HSP60一抗(1 :500),4 ℃孵育过夜。d 2 TBST液漂洗10 min×3次,加二抗孵育1 h,TBST漂洗10 min×3次,采用ECL发光试剂盒显影并采集图像。
1.2.4 细胞培养H9c2心肌细胞用含10%无外泌体血清的DMEM/F-12培养液培养,于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。选取对数生长期的细胞用于实验。当细胞密度在80%~90%时,用0.25%胰酶消化约2 min,以1 :3的比例传代,每隔2~3 d传代1次。
1.2.5 建立心肌细胞H/R损伤模型参照文献[7]介绍的方法,换去H9c2细胞正常培养时的完全培养基,加入无血清无糖的缺氧液(139 mmol·L-1 NaCl、4.7 mmol·L-1 KCl、0.5 mmol·L-1 MgCl2、1.0 mmol·L-1 CaCl2、5 mmol·L-1 HEPES,pH 7.4),细胞置于缺氧小室中,通入95% N2-5% CO2饱和10 min, 以驱除小室内的氧气,随后将缺氧小室放入37 ℃培养箱中培养5 h进行缺氧,然后用含10%胎牛血清的完全培养基正常培养1 h进行复氧。
1.2.6 实验分组及处理H9c2心肌细胞随机分为4组:①对照组(Control组):H9c2细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养; ②缺氧/复氧组(H/R):将H9c2细胞进行5 h缺氧和1 h复氧处理; ③H/R+CON-Exo组:将CON-Exo以20 mg·L-1的终浓度加入H9c2心肌细胞培养液,与心肌细胞共孵育12 h后,进行H/R处理; ④H/R+MPC-Exo组:将MPC-Exo以20 mg·L-1的终浓度加入H9c2心肌细胞培养液,与心肌细胞共孵育12 h后,进行H/R处理。
1.2.7 心肌细胞活性的检测将H9c2细胞接种于96孔培养板,每孔104个,按上述方法进行分组及处理后,每孔加入10 μL CCK-8溶液(培养基100 μL),在细胞培养箱内孵育4 h后,酶标仪上于波长450 nm处测定各组吸光度,空白对照孔为不含细胞的培养液。H9c2心肌细胞活力为实验测定孔吸光度值减去空白对照孔吸光度值。计算各组平均值。实验独立重复3次。
1.2.8 检测LDH活性接种在96孔板的H9c2细胞按照以上进行分组及处理后,每组各取40 μL细胞培养上清液,按照LDH试剂盒说明书操作,利用酶标仪于450 nm处测定各孔吸光度,根据公式计算各组LDH活性。实验独立重复3次。
1.2.9 Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡将H9c2心肌细胞以2×106个/孔接种在6孔培养板,按照上述进行分组及处理,结束后,0.25%胰酶(不含EDTA)消化,PBS洗涤细胞2次,1 000×g离心5 min,收集细胞,用500 μL 1×binding buffer重悬细胞,每组加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,轻轻混匀后,室温避光反应15 min,随即流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。以单染Annexin-V-FITC细胞和单染PI细胞作为基准参照,每个样本获取3×104个细胞,以FCS Express V 3.0软件进行分析。实验独立重复3次。
1.2.10 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行数据分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用Tukey检验。
2 结果 2.1 大鼠血清外泌体的鉴定对分离得到的外泌体进行鉴定,电镜下可见圆形或椭圆形囊泡结构,大小较均一,直径在30~100 nm之间(Fig 1A)。Western blot结果表明,其中含有外泌体标志性蛋白CD63、HSP60(Fig 1B)。说明已从大鼠血清中成功提取了血清外泌体。BCA蛋白定量结果是CON-Exo(7.23±0.25) g·L-1,MPC-Exo(14.87±1.29)g·L-1,用测定的外泌体中蛋白浓度表示外泌体浓度,说明MPC可诱导血清外泌体释放明显增加(P < 0.01,Fig 1C)。
2.2 MPC-Exo增加H9c2心肌细胞活力心肌细胞活力检测结果显示(Fig 2),与对照组相比,H/R组细胞活力明显降低(P < 0.01);与H/R组相比,H/R+MPC-Exo组细胞活力增加(P < 0.01), 而H/R+CON-Exo组细胞活力无明显增加,差异无统计学意义,说明MPC-Exo能增加细胞活力。
2.3 MPC-Exo降低H9c2心肌细胞LDH的活性细胞损伤的程度可以用细胞培养液中LDH的水平来表示。如Fig 3所示,与对照组相比,H/R组心肌细胞H/R损伤后LDH活性明显增加(P < 0.01);与H/R组相比,H/R+MPC-Exo组可减轻心肌细胞H/R损伤,降低H9c2心肌细胞LDH的活性(P < 0.01), H/R+CON-Exo组LDH活性无明显变化,差异无统计学意义。说明MPC-Exo可降低H9c2心肌细胞LDH的活性。
2.4 MPC-Exo减少H9c2心肌细胞凋亡Annexin-V-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡,Fig 4结果显示,与对照组相比,H/R组凋亡细胞(右上象限、右下象限)明显增多(P < 0.01)。与H/R组相比,H/R+MPC-Exo组凋亡细胞明显减少(P < 0.05), 而H/R+CON-Exo组心肌细胞凋亡率无明显变化,差异无统计学意义。表明MPC-Exo能减少H9c2心肌细胞凋亡,减轻H/R损伤。
3 讨论外泌体可通过运载内源性蛋白、脂质、miRNA等作用于靶细胞,介导细胞间的信息交流,在正常的生理功能过程以及疾病的发生、发展中均发挥着重要作用。大量研究表明,外泌体能向受体细胞传递蛋白质和遗传信息[8],从而介导细胞间的信号传递。外泌体在心血管疾病中具有重要作用,近年来得到广泛关注。有研究发现,血浆外泌体可以介导HSP70蛋白的转运,激活心肌细胞内ERK和p38 MAPK通路,从而发挥心肌保护作用[9]。间充质干细胞来源的外泌体能明显减小小鼠的心肌梗死面积,通过增加腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的水平,减少氧化应激,激活PI3K/Akt通路,从而减轻IRI[10]。在小鼠心肌IRI模型中,心脏祖细胞来源的外泌体可以明显减轻心肌细胞凋亡,并且发现这些外泌体含有丰富的miR-451,能促进血管生成,改善心脏功能[11]。这些均表明外泌体具有心肌保护作用,如果缺血心肌在早期得到具有心肌保护性的外泌体预处理,其心肌损伤的程度可以得到一定的逆转,这可能为缺血性心脏病提供了一种新的治疗方法。
吗啡是一种主要作用于μ受体的激动药,具有较强的镇痛性,是广泛应用于心脏和大血管手术围术期镇痛的常用药物。我们前期的研究发现,MPC具有缺血预处理类似的心肌保护作用,减轻心肌IRI[12],其机制仍待进一步探讨。本研究通过在大鼠体内进行MPC,预处理结束后收集血液,随后分别提取MPC组和对照组血清中的外泌体,结果表明MPC组外泌体浓度明显高于对照组,表明MPC诱导了外泌体的产生,增加了外泌体的进一步释放。有研究表明,星形胶质细胞经吗啡处理后,培养液中外泌体释放量明显增加,其携带的miR-29b可被邻近神经元摄取,从而调控基因表达,说明外泌体介导的miRNA转运可能是吗啡发挥生物学作用的一个重要途径[13]。
为了进一步验证MPC诱导释放的大鼠血清外泌体对H/R损伤的影响,将MPC-Exo与H9c2心肌细胞共孵育12 h,随后进行H/R损伤,研究结果表明,MPC-Exo能增加H9c2心肌细胞活力,降低LDH的活性,减少心肌细胞凋亡,而CON-Exo并未有此作用。心肌细胞凋亡是IRI中的重要事件,本研究发现的MPC诱导释放的大鼠血清外泌体能明显减少心肌细胞损伤与凋亡,从而减轻H/R损伤,发挥心肌保护作用,这对进一步了解外泌体对心肌细胞功能的影响具有重要价值。同时有研究发现,缺血预处理可以刺激富含miRNA-144的外泌体的释放,而miRNA-144激活PI3K/Akt和ERK信号通路,从而发挥心肌保护作用[14]。缺血预处理后提取间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cells derived exosomes,MSC-Exo),发现其富集miR-22,在体实验证明MSC-Exo可以减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化,主要机制可能与miR-22对其目标蛋白甲基化的CpG结合蛋白-2的作用有关[15]。我们前期研究证明,MPC通过上调心肌细胞miR-133b-5p水平,抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡[6]。据此,我们推测MPC诱导释放的血清外泌体可能携带包括miR-133b-5p在内的心肌保护性miRNA,作用于心肌细胞发挥保护作用,但这一推论仍待进一步研究证实。本研究主要是在H9c2细胞上进行的,H9c2细胞是大鼠胚胎心肌细胞株,因其易于培养且可传代,故广泛应用于体外研究。但它不同于原代的乳鼠心肌细胞和成年心肌细胞,因而MPC诱导释放的大鼠血清外泌体是否能够减轻原代心肌细胞H/R损伤,发挥心肌保护作用,有待于进一步研究。
综上所述,本研究表明,MPC诱导释放的大鼠血清外泌体可以减轻H9c2心肌细胞H/R损伤,发挥心肌保护作用,为阿片类药物心肌保护机制研究提供了新的思路和靶点。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学第二附属医院科研实验中心完成,感谢各位老师和同学的帮助。)
[1] | Binder A, Ali A, Chawla R, et al. Myocardial protection from ischemia-reperfusion injury post coronary revascularization[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2015, 13(9): 1045-57. doi:10.1586/14779072.2015.1070669 |
[2] | Chen Z, Hu Z, Lu Z, et al. Differential microRNA profiling in a cellular hypoxia reoxygenation model upon posthypoxic propofol treatment reveals alterations in autophagy signaling network[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013: 378484. |
[3] | Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends[J]. J Cell Biol, 2013, 200(4): 373-83. doi:10.1083/jcb.201211138 |
[4] | Ailawadi S, Wang X, Gu H, et al. Pathologic function and therapeutic potential of exosomes in cardiovascular disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(1): 1-11. doi:10.1016/j.bbadis.2014.10.008 |
[5] | Giricz Z, Varga Z V, Baranyai T, et al. Cardioprotection by remote ischemic preconditioning of the rat heart is mediated by extracellular vesicles[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014, 68: 75-8. doi:10.1016/j.yjmcc.2014.01.004 |
[6] | He S F, Zhu H J, Han Z Y, et al. MicroRNA-133b-5p is involved in cardioprotection of morphine preconditioning in rat cardiomyocytes by targeting Fas[J]. Can J Cardiol, 2016, 32(8): 996-1007. doi:10.1016/j.cjca.2015.10.019 |
[7] | 韩正怡, 何淑芳, 程洁, 等. 吗啡预处理对H9c2心肌细胞缺氧/复氧microRNA表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(11): 1552-7. Han Z Y, He S F, Cheng J, et al. Effects of morphine preconditioning on expression of microRNAs during hypoxia-reoxygenation in H9c2 myocardial cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(11): 1552-7. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.11.015 |
[8] | Yuan M J, Maghsoudi T, Wang T. Exosomes mediate the intercellular communication after myocardial infarction[J]. Int J Med Sci, 2016, 13(2): 113-6. doi:10.7150/ijms.14112 |
[9] | Vicencio J M, Yellon D M, Sivaraman V, et al. Plasma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion injury[J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 65(15): 1525-36. doi:10.1016/j.jacc.2015.02.026 |
[10] | Arslan F, Lai R C, Smeets M B, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res, 2013, 10(3): 301-12. doi:10.1016/j.scr.2013.01.002 |
[11] | Chen L, Wang Y, Pan Y, et al. Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 431(3): 566-71. doi:10.1016/j.bbrc.2013.01.015 |
[12] | 胡军, 张野, 陆姚, 等. NO/cGMP信号通路在鞘内吗啡预处理减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(6): 829-33. Hu J, Zhang Y, Lu Y, et al. Role of NO /cGMP in the cardioprotective effects of intrathecal morphine preconditioning against ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(6): 829-33. |
[13] | Hu G, Yao H, Chaudhuri A D, et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction[J]. Cell Death Dis, 2012, 3(8): e381. doi:10.1038/cddis.2012.114 |
[14] | Przyklenk K. MicroRNA-144 is a circulating effector of remote ischemic preconditioning[J]. Basic Res Cardiol, 2014, 109(5): 423. doi:10.1007/s00395-014-0423-z |
[15] | Feng Y, Huang W, Wani M, et al. Ischemic preconditioning potentiates the protective effect of stem cells through secretion of exosomes by targeting Mecp2 via miR-22[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e88685. doi:10.1371/journal.pone.0088685 |