2. 中山大学肿瘤防治中心药学部,广东 广州 510060;
3. 广东药科大学药学院,广东 广州 510006
2. Dept of Pharmacy, Sun Yat-sen University Cancer Center, Guangzhou 510060, China;
3. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是源于上皮黑色素细胞的恶性肿瘤,是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种,其具有发病隐蔽、转移率高、放化疗敏感性低的特点,因而常导致患者预后不佳、死亡率高。目前,我国黑色素瘤发病率较低,但其危害性以及总体死亡率却逐年上升[1]。研究表明,黑色素瘤细胞对放疗的敏感性低,原因是其产生的黑色素可削弱射线的杀伤作用。目前,随着人们对黑色素瘤发病机制研究的不断深入,一系列疗效明显的新药逐渐研发面世,包括重组人源抗PD-1单抗Nivolumab,抗CTLA-4单克隆抗体Ipilimumab,BRAF V600E突变抑制剂Vemurafinib、Dabrafenib等免疫靶向药物[2]。尽管这些药物在临床试验中均取得满意的疗效,然而该类药物价格高昂,国内市场流通量少,毒副作用仍未明确,尚难普及使用,未能惠泽日益增多的患者。因此,通过中医药寻找安全低毒、有效经济的活性物质,是目前我国药物研究的热点。
柯里拉京(corilagin,Cor)是一种逆没食子酸鞣质,为酚类化合物,在植物中广泛分布。Cor是有多种药理活性的天然产物,具有抗氧化、抗炎、保护肝脏等活性,在抗肿瘤方面,可明显抑制卵巢癌、人肝癌、喉癌等癌细胞的体外生长[3]。基于其抗肿瘤方面的作用,课题组开展了研究龙眼果核的植物多酚成分,发现龙眼果核中富含Cor[4];并对其中的多个物质进行活性研究,发现Cor对黑色素瘤细胞具有明显的抑制作用[5],但其对细胞蛋白表达以及相关信号通路的影响均未见深入研究。本项目以人源性的MM细胞A375为病理模型,研究Cor对细胞活性、凋亡通路蛋白的表达以及黑色素生成的影响,初步探讨Cor对黑色素瘤产生抑制作用的机制。
1 材料与方法 1.1 细胞人MM细胞株A375,由中山大学实验动物中心提供。
1.2 药物与试剂Cor(自制,经测定其含量达99.1%); Hoechst 33258、酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量检测试剂盒,美国Sigma Aldrich公司; CCK-8试剂盒,东仁化学科技(上海)有限公司; 高糖DMEM培养基、特级胎牛血清(FBS),美国Gibco公司; AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司; Bcl-2、Bax、β-actin、cleaved-caspase-3、p-Akt、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphatased glycogen synthesis kinase 3β, p-GSK-3β)、周期蛋白D1(cyclin D1)等一抗以及二抗,Cell Signaling Technology公司。
1.3 仪器311型细胞培养箱、Sorvall ST 40台式离心机(美国Thermo公司); 荧光倒置显微镜(德国Leica公司); 酶标仪(美国Bio-Tek公司); FACSVerse流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。
1.4 细胞培养将A375细胞接种于含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1硫酸链霉素的高糖DMEM中,在37 ℃、饱和湿度、5% CO2、95%空气的细胞培养箱中培养。待细胞生长覆盖约至80%时,用2.5 g·L-1胰酶消化传代,并按3×107·L-1密度接种于培养板或培养瓶内待用。
1.5 细胞存活率的检测将A375细胞接种于96孔板中,接种12 h后,换无血清高糖DMEM培养基,12 h后分别加入终浓度为5、10、20、40、80 μmol·L-1的Cor,并设置空白细胞对照组,各组作用24 h后,加入10 μL CCK-8,37 ℃温育2 h后,测定各组吸光度(A值)。每组设6个复孔,所得A值按下列公式计算细胞存活率:细胞存活率= Cor组A450值/空白细胞组A450值×100%。
1.6 细胞凋亡形态的观察将A375细胞接种于6孔板中,培养至细胞汇合度达80%~90%,根据“1.5”项实验结果,设置Cor低、中、高(20、40、80 μmol·L-1)组以及空白细胞对照组,各组作用24 h后,用PBS小心冲洗,多聚甲醛固定后,冲洗,Hoechst 33258染色后,荧光显微镜观察细胞情况。
1.7 细胞凋亡率的检测将A375细胞接种于6孔板中,按“1.6”项分组处理后,弃去培养液,PBS小心洗涤,加入2.5 g·L-1胰酶(不含EDTA),于37 ℃消化后,用完全培养基终止消化,收集细胞悬液,1 000 r·min-1离心10 min,弃上清,收集细胞后,按照试剂盒提供的步骤进行Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪检测A375细胞的凋亡率。
1.8 蛋白表达量的检测将A375细胞接种于6孔板中,按“1.6”项分组处理后,用冰冷的PBS冲洗2次,收集细胞并加入预冷细胞裂解液,4 ℃裂解30 min,12 000 r·min-1低温离心15 min,去除细胞碎片等杂质,取上清液,BCA法测定蛋白量。用含12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白,然后转移到PVDF膜上,5% BSA封闭90 min,加入稀释好的一抗,4 ℃孵育过夜。洗膜后,加入二抗,37 ℃孵育1 h,再洗1遍,成像进行灰度分析,并与内参(β-actin)作比较,计算各检测蛋白的相对表达量。
1.9 酪氨酸酶活性的检测将A375细胞接种于96孔板,待生长至近融合状态,按“1.6”项分组处理,加入不同浓度的Cor,作用24 h后弃培养液,用pH 7.4的PBS小心洗涤2次,每孔加入1% Triton X-100溶液90 μL,迅速置-80 ℃冻存30 min,随后室温融化使细胞完全裂解,37 ℃预温后,加入2.5 mmol·L-1多巴溶液100 μL,37 ℃反应0.5 h,490 nm处测定A值。酪氨酸酶活性抑制率= (1-Cor组A490值/空白细胞组A490值)×100%。
1.10 黑色素含量的测定将对数生长期A375细胞接种于24孔板,24 h后加入不同浓度的Cor。培养2 d后,胰酶消化,将细胞收集入离心管,1 000 r·min-1离心10 min,倾去上清液,再用PBS洗2次后,用1 mol·L-1氢氧化钠溶液(含10% DMSO)在37 ℃作用48 h,充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒,于405 nm处测定A值。
1.11 统计学方法利用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,实验数据均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果 2.1 Cor对A375细胞的抑制作用如Fig 1所示,与对照组相比,Cor对A375细胞有明显的抑制作用,随着作用浓度的增加,细胞活力逐渐降低,当浓度达到10 μmol·L-1时,已开始出现明显的抑制作用(P<0.05),在Cor浓度为20、40、80 μmol·L-1时,抑制作用明显逐渐增强(P<0.01)。因此,后续实验均设此3个浓度组进一步研究分析。
2.2 Cor诱导A375细胞凋亡形态变化通过Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡情况,亮蓝色的凋亡小体的数量反映出细胞的凋亡程度。如Fig 2所示,对照组细胞的荧光较暗,着色均匀,基本不出现凋亡小体,表明细胞状态良好; 随着Cor浓度的增加,凋亡小体数量明显增多(图中箭头所示)。结果表明,Cor (20、40、80 μmol·L-1)可引起并促进黑色素瘤细胞凋亡。
2.3 Cor诱导A375细胞凋亡率明显升高如Fig 3所示,细胞凋亡率为右上区与右下区细胞所占比例之和。与对照组相比,Cor组细胞凋亡数量明显增多,细胞凋亡率随Cor浓度增加而增加(P<0.01)。结果表明,Cor对黑色素瘤细胞的凋亡有明显的促进作用。
2.4 Cor降低Bcl-2表达,增加Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达水平如Fig 4所示,Cor组的Bcl-2表达量均明显低于对照组,而Bax、cleaved caspase-3的表达量以及Bax/Bcl-2比值与对照组相比则明显上升。结果表明,Cor能够通过下调Bcl-2表达,上调Bax表达以及促进caspase-3裂解活化,促使黑色素瘤细胞凋亡。
2.5 Cor降低p-Akt、p-GSK-3β、cyclin D1蛋白表达量如Fig 5所示,与对照组相比,Cor能明显下调p-Akt、p-GSK-3β、cyclin D1的表达。
2.6 Cor明显抑制A375细胞中酪氨酸酶活性酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶,是黑色素瘤存在和转移发生的标志,可作为黑色素瘤的诊断以及治疗预后评价的重要指标[6]。通过检测A375细胞中的酪氨酸酶含量的变化,判断Cor对黑色素生成过程的影响。Tab 1结果显示,与对照组比较,Cor组对A375细胞中酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用(P<0.01),且呈浓度依赖性。
Group | Inhibitory rate of tyrosinase/% | Relative content of melanin/% |
Control | 1.4±0.1 | 100.0±3.9 |
20 μmol·L-1 Cor | 32.7±7.9** | 78.7±5.1* |
40 μmol·L-1 Cor | 46.3±4.8** | 62.8±3.7** |
80 μmol·L-1 Cor | 58.5±5.3** | 57.1±2.9** |
*P<0.05, **P<0.01 vs control |
黑色素含量变化是判断黑色素瘤发生、发展以及对放疗敏感性的重要指标[7]。通过检测给药前后,细胞中黑色素含量变化,能有效评价Cor对黑色素生成的影响,以及对酪氨酸酶作用效果的验证。Tab 1结果显示,与对照组比较,Cor能有效抑制A375细胞中黑色素的生成,其作用效果随着Cor浓度增加而增强。
3 讨论研究表明,黑色素瘤细胞对放疗敏感性低的原因是其产生的黑色素对于射线损伤具有保护作用[8]。因此,寻找能有效抑制黑色素形成,防止黑色素瘤侵袭转移的天然植物中的活性成分,是目前治疗研究热点。本研究中,Cor是一种具有广泛生物活性的植物多酚,具有明显抗肿瘤作用,并抑制肿瘤细胞迁移侵袭[9]。
本项目中CCK-8细胞活性检测结果显示,Cor对A375细胞有明显的抑制作用。Hoechst 33258检测A375细胞凋亡形态学特征表明,随着Cor浓度的增加,凋亡细胞明显增加。流式细胞术结果显示,在Cor 20~80 μmol·L-1能促进A375细胞的凋亡,并根据凋亡图像分析,随着Cor浓度的增高,凋亡晚期的细胞明显增多。
caspase家族是细胞凋亡的重要介质。其中caspase-3是一种在凋亡发生时频繁启动的死亡蛋白酶,催化许多关键细胞蛋白的特异性裂解,在细胞凋亡途径的最终端效应中起着关键作用。活化型的caspase-3 (cleaved caspase-3)对凋亡信号起传递和放大作用,从而加速细胞凋亡的发展。cleaved caspase-3是恶性肿瘤不可缺少的检查项目之一。
在细胞的线粒体凋亡途径中,Bcl-2家族也是目前研究较多的蛋白,其在线粒体介导的凋亡途径中起关键的调控作用。研究表明,Bax/Bcl-2比例的升高,能增大线粒体膜的通透性,启动线粒体凋亡途径,引起细胞损伤[10]。在临床治疗应用中,Bcl-2与Bax比值用于疾病的诊断和治疗方案的设计; 在肿瘤防治方面,可判断及评价肿瘤药物治疗效果,是否出现耐药性以及复发的指标之一[11]。本项目通过检测caspase-3的活性片段cleaved caspase-3以及Bcl-2、Bax的表达,研究Cor对A375细胞凋亡信号通路的影响,并初步研究Cor对人MM作用方式以及机制。Western blot结果显示,在Cor作用下,随着作用浓度的增加,Bcl-2的表达逐渐下降,并且Bax表达增加,从而使Bax/Bcl-2的比例增加,引起细胞凋亡,表明Cor引起A375细胞凋亡与其影响Bcl-2以及Bax的表达相关。结果表明,在Cor作用下,cleaved caspase-3的表达明显上升,并且其表达量随着浓度的增加而增加,表明caspase-3裂解活化的程度增强,细胞的凋亡进程加速,细胞凋亡增加,表明Cor能影响cleaved caspase-3的表达。提示Cor可能通过Bcl-2蛋白家族介导线粒体途径,引起A375细胞凋亡。
研究证实,Akt/GSK-3β/cyclin D1信号通路与肿瘤细胞的存活增殖、侵袭转移均有密切联系[12]。MM存在着Akt信号通路的异常活化,本项目通过研究Cor对p-Akt及下游p-GSK-3β、cyclin D1等蛋白表达的影响,观察其抑制A375细胞的作用机制。
Cyclin D1是细胞周期蛋白中最重要的一员,其主要功能是驱动细胞由G1期进入S期。G1期是细胞在增殖过程中能接受外界信号的唯一时期,cyclin D1可激活周期蛋白依赖性激酶CDK4,推进细胞周期发展,因此相对于其他周期蛋白成员,cyclin D1可作为一个研究细胞生长状况更为有效的指标。目前研究认为cyclin D1为原癌基因,其过度表达和基因扩增均可加快细胞周期循环,进而导致细胞增殖失控,甚至引起细胞恶化。因此,选择检测cyclin D1的表达量,考察Cor对A375细胞增殖的影响。研究表明,当GSK-3β被激活的Akt磷酸化后,可促进cyclin D1泛素化,使其发生降解。可见Akt/GSK-3β/cyclin D1通路调控细胞生长增殖的机制为Akt在PI3K的作用下磷酸化生成p-Akt,继而促使GSK-3β磷酸化生成p-GSK-3β,降低GSK-3β对cyclin D1的抑制作用,延长cyclin D1的半衰期,促使细胞增殖加快,乃至发生癌变恶化[13]。实验结果显示,Cor明显降低A375细胞中p-Akt、p-GSK-3β、cyclin D1等蛋白的表达,表明Cor可通过抑制Akt的活性,加强GSK-3β对cyclin D1的抑制作用,遏制细胞周期的进展,最终产生抑制黑色素瘤的作用。此外,研究表明,Akt可以作用于Bad以及caspase-9等线粒体凋亡通路相关蛋白,抑制细胞的凋亡[14]。结合本实验结果分析,可以推断,Cor在抑制Akt活性的过程中,不仅参与到Akt/GSK-3β/cyclin D1信号通路的调控,还可通过降低Akt的活性,激活Bax和caspase-9启动凋亡程序的功能,使Bax发生聚合反应,活化以及促进caspase-9的下游通路蛋白caspase-3裂解活化,最终使细胞的凋亡过程得以完成。
本项目研究结果表明,Cor能明显降低A375细胞中酪氨酸酶的活性,减少黑色素的形成,提示其潜在治疗MM的作用。有学者报道,富含Cor的龙眼核多酚提取物能够与酪氨酸酶的铜离子活性中心结合,拮抗酪氨酸酶的激活,从而抑制酶的催化作用[15]。Cor对酪氨酸酶以及黑色素形成的影响与其引起细胞凋亡的信号通路是否有潜在联系,需要进一步实验验证。揭示Cor降低A375细胞中黑色素含量的机制,有助于其在黑色素瘤治疗中的开发应用。
( 致谢: 本实验主要在广东药科大学药学院以及中心实验室完成,感谢臧林泉教授以及药理教研室老师的指导与帮助!)
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