2. 天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室，天津 300162;
3. 武警后勤学院附属医院心血管内科，天津 300162;
4. 武警后勤学院病原生物学教研室，天津 300309
2. Tianjin Key Lab of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury, Logistics University of the Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
3. Dept of Cardiology, the Affiliated Hospital of Logistics University of the Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
4. Dept of Pathogen Biology, Logistics University of the Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300309, China
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重危害健康的常见心血管疾病，主要病理表现为动脉管壁内脂质沉积，进而形成粥样斑块。AS斑块破裂又可导致一系列严重后果，如心绞痛、心肌梗死、脑血管破裂，甚至猝死。近年研究发现，中性粒细胞可以释放核酸到细胞核外，与组蛋白和髓过氧化物酶等形成网状纤维结构，即中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)，参与AS的病程进展[1-2]。此外，单核细胞的变化也贯穿AS发生、发展全过程，并与NETs的形成关系密切。鉴于NETs与单核细胞以及两者的交互影响在AS病程进展中的重要作用，对其进一步深入研究已成为防治AS的新方向。曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)是临床常用的抗心绞痛药物，我们前期首次发现，TMZ可明显抑制小鼠缺血/再灌注损伤引发的左心室结构改变和功能障碍，改善缺血心肌的能量代谢，从而保护心肌组织损伤[3]，但其能否通过调节NETs以及单核细胞亚群，影响AS进程尚未见报道。本研究初步探讨TMZ对AS的干预作用及潜在机制，为扩展TMZ的临床适应症，揭示其更多的药理学作用机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器TMZ、油红O购自Sigma公司；辛伐他汀购自广州南新制药有限公司(批号：BN 3139234)；小鼠抗CD11b-PE、Ly6G-PerCP/Cy5.5、Ly6C-FITC抗体、Ly6G-PE抗体，均购自eBioscience公司；刺激剂(Leukocyte Activation Cocktail)购自BD公司；HistoneH3、羊抗兔IgG、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗体、Hoechst 33258，均购自Abcam公司；甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)检测分析试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。小动物超声仪Vevosonic2100(加拿大Fujifilm VisualSonics公司)；流式细胞仪Cytomics FC 500和BD FACSAriaTM Ⅲ(Beckman Coulter公司)；冰冻切片机CM1850(德国Leica公司)；显微镜ECLIPSE 80i(日本Nikon公司)；荧光定量PCR仪ABI 7300(美国Applied Biosystems公司)。
1.2 实验动物8周龄♂ApoE-/-小鼠40只，C57BL/6小鼠10只，体质量(22.5±3.5)g，均购自天津市奥臣实验动物销售有限公司，动物批号：1601826。ApoE-/-小鼠实验前经DNA检测为纯合子。
1.3 动物模型的制备及药物干预所有实验动物适应性喂养1周。C57BL/6小鼠作为对照组，给予普通饮食；ApoE-/-小鼠给予高脂饮食(高脂饲料购自南通特洛菲饮食饲料科技有限公司，饲料代码：TP26303)，饲养8周后，ApoE-/-小鼠随机分为4组(每组10只)，依据以下分组，给予相应剂量的药物进行干预，分别为模型组(0.9% NaCl)、辛伐他汀组(3 mg·kg-1·d-1)、TMZ低、高剂量组(10、20 mg·kg-1·d-1)。连续灌胃12周后取材。
1.4 血脂含量检测实验结束后，各组小鼠2.5%异氟烷气体麻醉，眼球取血，静置30 min，3 000 r·min-1离心15 min，取上清，-80℃储存备用。根据试剂盒说明书，采用分光光度计检测各组小鼠血清TG和TC含量。
1.5 油红O染色各组小鼠以PBS灌流心脏，于主动脉根部上2 mm处留取心脏，沿左、右心耳下缘连线平行向下2 mm处去掉心尖部，留取心底部分，于30%的蔗糖溶液中脱水下沉后，OCT包埋，冰冻切片，厚度8 μm，常规油红O染色，光学显微镜下观察主动脉窦斑块面积及主动脉窦狭窄程度，使用Image-Pro Plus 6.0软件计算斑块面积及主动脉狭窄程度。
1.6 小动物超声检测主动脉弓内-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)2.5%异氟烷气体麻醉小鼠后，将其固定于超声加热板，脱毛膏脱掉胸部绒毛，涂抹耦合剂，采用小动物超声检测内膜回声至中膜-外膜回声之间的垂直距离[4]，于动脉收缩期测量3次，求平均值。
1.7 流式细胞术检测循环单核细胞抗凝EP管收集各组小鼠外周血，50 μL抗凝全血加入Ly6G-PerCP/Cy5.5、Ly6C-FITC、CD11b-PE，细胞染色缓冲液吹打混匀，室温避光孵育15 min，加入600 μL红细胞裂解液，流式细胞仪迅速上机检测，使用CXP2.0软件分析数据。
1.8 流式细胞术检测NETs水平[5]取100 μL外周血，500×g离心5 min后，弃上清，加入红细胞裂解液，2 min后，离心弃上清，用含2% BSA的DPBS重悬细胞，加入刺激剂，在37℃、5% CO2条件下孵育5 h，多聚甲醛固定，用含2% BSA的DPBS封闭过夜，复温后，加抗Histone H3在37℃孵育30 min，离心弃上清，重悬细胞，加入二抗IgG、MPO-FITC、Hoechst-DAPI、Ly6G-PE抗体，37℃孵育30 min，流式细胞仪检测，使用FlowJo 7.6.1软件分析结果。
1.9 qRT-PCR检测小鼠脾脏IL-1β、IL-18基因表达TRIzol法提取小鼠脾脏RNA，按照反转录cDNA合成试剂盒(Roche公司)说明书，将总RNA反转录为cDNA，取反转录后cDNA作为模板，使用SYBR Green Master进行定量PCR。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以β-actin作为内参。每个样品分别设3个平行孔，反应总体系为20 μL，引物序列如下，β-actin:F 5′-CTAAGGCCAACCGT GAAAAG-3′, R 5′-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3′; IL-1β:F 5′-AACGTGTGGGGGATGAATTG-3′, R 5′-CATACTCATCAAAGCAATGT-3′; IL-18:F 5′-ACTACCTCAACCGTTCCACG-3′, R 5′-TTCCCTCCGCATTGACACAG-3′。
1.10 统计学分析所有数据以x±s表示，GraphPad Prism 6软件进行统计学分析，组间对比采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 TMZ对血脂水平的影响与普通饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠体质量增长明显；给药后，小鼠体质量增长有一定程度减轻(数据未显示)。如Fig 1所示，与对照组相比，模型组TC、TG水平均明显升高(P < 0.05)，TMZ干预后，模型鼠血脂水平明显降低(P < 0.01，P < 0.05)。
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| Fig 1 Effects of trimetazidine on lipid TC(A) and TG(B) (x±s, n=10) ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
Fig 2的油红O染色结果显示，与对照组相比，模型组斑块负荷明显增多(P < 0.01)，TMZ及辛伐他汀干预组均明显减少主动脉窦斑块负荷，与模型组相比差异具有显著性(P < 0.05)，其中，TMZ低、高剂量组斑块负荷减少明显。
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| Fig 2 Effects of trimetazidine on atherosclerotic lesions (x±s, n=10) A: Control group; B: Model group; C: Low-dose trimetazidine group; D: High-dose trimetazidine group; E: Simvastatin group; F: The area of plaque in aortic root. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
Fig 3的小动物超声检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠主动脉弓部血管IMT明显增加(P < 0.01)；TMZ低、高剂量及辛伐他汀干预后，小鼠主动脉弓部血管IMT明显降低(P < 0.05)，且TMZ低、高剂量组小鼠IMT减小程度相比辛伐他汀组更明显。
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| Fig 3 Effects of trimetazidine on aortic IMT (x±s, n=10) A: Control group; B: Model group; C: Low-dose trimetazidine group; D: High-dose trimetazidine group; E: Simvastatin group; F:The thickness of the aortic wall. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
如Fig 4所示，与对照组小鼠比较，模型组Ly6G-CD116+Ly6Chi单核细胞亚群比例明显增加(P < 0.01)；TMZ低、高剂量组及辛伐他汀组明显降低小鼠Ly6G-CD116+Ly6Chi单核细胞亚群比例(P < 0.05)，且TMZ高剂量组比低剂量组降低趋势更明显。
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| Fig 4 Effects of trimetazidine on peripheral blood monocytes subset proportion (x±s, n=10) A: Gate strategy; B: Representative picture in each group; C: Percentage of monocyte subsets. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
如Fig 5所示，与对照组小鼠比较，模型组小鼠NETs水平明显增加(P < 0.01)；TMZ低、高剂量组及辛伐他汀组均明显降低模型小鼠NETs水平(P < 0.01)，但TMZ不同剂量间量效关系不明显。
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| Fig 5 Effects of trimetazidine on NETs (x±s, n=10) A: Gate strategy; B: Representative picture in each group; C: Percentage of NETs. ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs model. |
Fig 6实时定量PCR结果显示，与对照组相比，模型组小鼠IL-1β、IL-18基因表达明显上调(P < 0.01)；与模型组相比，TMZ低、高剂量组及辛伐他汀组小鼠IL-1β、IL-18基因表达水平均明显下降(P < 0.01，P < 0.05)。
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| Fig 6 Effects of trimetazidine on gene expression levels of IL-1β and IL-18 (x±s, n=10) ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
AS是由血脂异常引起，并由固有免疫和适应性免疫反应介导的慢性炎症性疾病。炎症反应是AS进展各个阶段的关键因素，其中促炎细胞因子加速AS进展，抗炎细胞因子改善疾病。因此，抑制免疫激活及其介导的炎症反应是针对AS的重要治疗策略。单核细胞作为AS进展中重要的炎症免疫反应细胞早已被证实，通常可分为促炎M1型和抑炎M2型两种经典表型，分别对应于小鼠的Ly6Chi和Ly6Clo细胞亚群。Ly6Chi单核细胞被认为是炎症状态下巨噬细胞和树突状细胞的前体，Ly6Clo单核细胞代表组织巨噬细胞的稳态前体细胞。研究发现，脂质代谢紊乱会使单核细胞向促炎型偏移，外周单核细胞亦可经C-C基序趋化因子配体2(CCL2)与其受体CCR2相互作用，穿过内皮屏障，朝炎症部位募集[6]，从而参与或加重AS的病程进展。我们前期亦证实，ApoE-/-小鼠模型中，炎症性单核细胞亚群比例随AS病变的加重而升高[7]。
AS中另一种重要的炎症相关固有免疫细胞中性粒细胞可通过NETs介导炎症反应，NETs形成过程中释放的MPO、DNA、抗微生物肽LL37等，可形成LL37-DNA复合物，并进入单核细胞，刺激DNA传感器分泌干扰素α(interferon α，IFN-α)，也会激活NF-κB通路，进一步产生大量炎症因子，如IL-1β、TNF-α。因此，NETs已经成为炎症性心血管疾病血管新的监测指标[8]。新近研究表明，NETs与单核细胞在AS过程中能够相互作用，放大炎症反应。例如，在AS早期阶段，中性粒细胞可通过释放类似导管素的刺激素，促进经典单核细胞聚集，Cl-Amidine(脱氨活性抑制剂)处理抑制肽精氨酸脱亚胺酶，能预防中性粒细胞形成NETs，从而降低AS斑块负荷，延缓颈动脉内血栓形成[9]。炎症因子中，IL-18、IL-1β属于相同结构家族。单核细胞是IL-1β的主要来源，IL-1β在单核细胞中会增强炎症反应，并促进AS斑块的不稳定性[10]。此外，AS中的胆固醇晶体亦能引发中性粒细胞释放NETs，进而诱导巨噬细胞释放炎症因子IL-1β等，并激活T细胞，促进AS斑块中的免疫细胞募集[11]。多效促炎因子IL-18可以在IFN-γ诱导下，由单核细胞产生[12]，并参与AS进展和斑块破裂，且在AS斑块中明显高表达。ApoE-/-小鼠给予IL-18可加速AS进展，IL-18结合蛋白(一种内源性IL-18抑制剂)的过度表达则抑制AS发生。特别是中性粒细胞浸润以及NETs的形成，也会刺激IL-1β和IL-18分泌，加速AS病程进展[11]。可见，IL-18、IL-1β与单核细胞和NETs关系密切，能够共同影响AS的发生、发展。
TMZ是一种促进心肌能量代谢的药物，在心肌缺血时可以通过调节脂肪酸和葡萄糖的氧化，提高心脏功能。近年发现，TMZ还具有良好的抗炎活性，例如，心衰动物模型给予TMZ治疗后，可使血浆C反应蛋白、TNF-α、IL-6等炎症因子水平明显下降[13]。在糖尿病大鼠模型中，TMZ能增强心脏舒张功能，其对心脏保护作用的机制可能与抑制炎症因子TNF-α，改善氧化应激损伤等有关[14]。此外，TMZ还能有效抑制炎症反应、膜破坏和氧化应激，减轻巨噬细胞浸润，从而明显改善脂多糖诱导的败血症、心肌功能障碍和心肌细胞凋亡。进一步机制研究显示，TMZ通过作用于Sirt1、AMPK、PPARα等信号通路，减轻巨噬细胞介导的炎症反应[15]，但其是否能通过抗炎活性，发挥对AS的保护作用尚不明确。
本研究中，我们以高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠为研究对象，首次应用TMZ进行干预。结果显示，TMZ及辛伐他汀都明显降低小鼠TC和TG的水平，抑制主动脉弓IMT增加，减少斑块面积，提示TMZ能够有效减轻AS斑块负荷，实验条件下，甚至优于辛伐他汀阳性对照组。此外，TMZ在明显减少NETs水平的同时，明显下调外周血Ly6Chi单核细胞比例，并且明显抑制炎症因子IL-1β、IL-18的基因表达。提示TMZ通过减少NETs表达，抑制单核细胞的炎症性偏移，从而减轻中性粒细胞和单核细胞介导的炎症反应，改善AS的病程进展。需要说明的是，本研究只是在动物水平上初步探讨了TMZ对AS的干预作用，并证实其通过调控NETs及炎症性单核细胞亚群，发挥抗AS效应，但对其具体的作用环节和分子机制等问题，仍需进一步研究阐明。
综上所述，TMZ作为游离脂肪酸氧化抑制剂，在临床上主要用于治疗缺血性心脏病和慢性心力衰竭，改善心室功能，尚未见其在AS治疗中的应用。本研究结果表明，TMZ不仅能有效改善AS的脂质代谢失衡，还明显抑制炎症性单核细胞亚群，调节NETs水平，为进一步拓展其临床应用提供了依据。
( 致谢: 本实验在天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室完成，感谢各位老师和同学的支持！)
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