2. 江苏大学附属人民医院麻醉科,江苏 镇江 212002;
3. 江苏大学医学院2015年级本科生,江苏 镇江 212013;
4. 江苏大学医学院2016年级本科生,江苏 镇江 212013
2. Dept of Anesthesiology, Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002, China;
3. Undergraduate Students of Class 2015, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China;
4. Undergraduate Students of Class 2016, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China
中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)在伤害性信息的下行抑制系统中处于至关重要的位置[1]。PAG的腹外侧(ventrolateral PAG, vlPAG)亚区是参与伤害性信息调制的重要区域。PAG发出的纤维终止于脊髓背角,参与脊髓水平伤害性信息的调制,PAG的研究重点集中在其vlPAG亚区[1-2]。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是PAG内重要的抑制性神经递质[2]。GABA能突触分泌的GABA与突触后GABA受体结合,后者包括GABAA受体和GABAB受体[1]。同时,谷氨酸是最重要的兴奋性神经递质。谷氨酸能突触分泌的谷氨酸与突触后谷氨酸受体结合,后者包括NMDA受体[3]和AMPA受体。由于GABAB受体既表达在谷氨酸能突触终末,也表达于GABA能突触终末上,因此,从理论上推断,GABAB受体激动剂可以激活这些受体,并抑制GABA能及谷氨酸能突触[4-6],继而抑制GABA和谷氨酸的释放。前期的实验结果也印证了这个推断[7-10]。
虽然GABAB受体被激活后,在神经系统内普遍引起“抑制效应”,但是研究人员很早就注意到,不同浓度的GABAB受体激动剂在PAG发挥的作用不同,继而通过影响下行抑制系统,产生“镇痛”与“致痛”作用[2, 11]。这些结果提示不同浓度的GABAB受体激动剂可能在PAG内对兴奋性突触和抑制性突触有影响,继而打破动态平衡而影响PAG的输出,最终造成对脊髓水平的伤害性信息调制的不同作用[7]。本实验试图用“饱和浓度”及“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂巴氯芬分别激活PAG内的谷氨酸能突触及GABA能突触,比较不同浓度的巴氯芬对上述两类突触的作用。根据已知的GABAB受体激动剂的药代动力学特征,本实验使用的“饱和浓度”和“非饱和浓度”的巴氯芬的浓度分别确定为5 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1[12]。最后,比较两种浓度对单个PAG细胞兴奋性的“净作用”(net effects),以探讨不同浓度GABAB受体激动剂引起不同作用的机制。
1 材料与方法 1.1 试剂巴氯芬和EGTA购自美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯,购自中国上海国药化学试剂公司。
溶液配制:①人工脑脊液(mmol·L-1,pH 7.2,渗透压约305 mOsm): NaCl 124、KCl 2.6、CaCl2 2.5、NaH2PO4 1.2、MgCl2 1.2、NaHCO3 25、葡萄糖11。②脑薄片切片液(mmol·L-1,pH 7.2):蔗糖212.7、KCl 4、CaCl2 0.5、NaH2PO4 1.23、MgCl2 10、NaHCO3 26、葡萄糖10。③记录电极内液1(pH 7.2,由CsOH调节, 渗透压约290 mOsm),记录抑制性突触后电流(mmol·L-1):甲基硫酸铯85、CsCl 50、HEPES 10、MgCl2 2.5、Na2-ATP 4、Na3-GTP 0.4、Na-phosphocreatine 10、EGTA 0.6。④记录电极内液2(pH 7.2,由KOH调节, 渗透压约290 mOsm),记录兴奋性突触后电流(mmol·L-1): K-gluconate 135、KCl 5、CaCl2 0.5、MgCl2 2、EGTA 5、HEPES 5、Mg-ATP 3.6。
1.2 实验动物6~8周龄♂ Sprague-Dawley (SD)大鼠,购自江苏大学实验动物中心,实验许可证号为SCXK (苏) 2013-0011。本实验有关使用动物的程序均经江苏大学实验动物伦理委员会批准,符合相关伦理规范。
1.3 PAG脑片的制作PAG脑片的制作方法参见文献[7-9],异氟醚吸入将大鼠深度麻醉,于第2颈椎水平迅速断头;沿颅正中线剪开大鼠头部皮肤,暴露颅骨,以尖嘴骨剪从椎孔向上沿颅骨矢状缝向前剪开至双眼连线位置,小心剥开切除颅骨,暴露鼠脑,以专用刮刀剥离全脑(包括大脑、中脑、小脑和部分脑干)。浸入用混合气体(95% O2+5% CO2)充盈饱和的冰冷的人工脑脊液中;在解剖显微镜(江西上饶凤凰光学仪器公司)下,仔细修剪大脑,用手术刀修去多余部分,得到1个包含中脑的脑块;将脑块轻贴附于琼脂块上,用速干胶将琼脂块黏于7000smz-2振动切片机(英国Campden Instruments公司)载物台上,横切薄片厚度设定为350 μm,振动频率为80 Hz,刀片前进速度为0.1 mm·s-1;将横切的包含PAG的中脑薄片放在约36 ℃的人工脑脊液中孵育30 min, 再转移到室温22~24 ℃人工脑脊液中保存备用。全程液体均由上述混合气体充盈,以维持必要的酸碱度和氧气浓度。
1.4 全细胞记录在室温条件下,将1枚切片移至记录槽中,维持人工脑脊液灌注,速率6~8 mL·min-1。低倍镜下选取PAG薄片的腹外侧部分,再将高倍镜置于该区域,使用BX51WI相差显微镜(日本Olympus公司)配合红外水浸镜头在明视野下采集图像,并连接至监视器,观察神经元,选取“健康饱满”的PAG细胞准备记录。
P-97微电极拉制仪(美国Sutter Instrument公司)将玻璃毛坯拉制成尖端约1 μm的记录电极,由电极后端充以电极内液。从电极后端给予适当大小正压,防止尖端堵塞。电极尖端进入液体后,电阻约为4~6 MΩ。使用微操纵器移动电极,使其尖端移动至选定的神经元细胞膜表面,并形成“酒窝”后,释放正压,改为适当负压吸引细胞,形成“巨欧姆”封接(电阻>1 GΩ),对电极内施加连续的短暂负压,使电极尖端吸住的细胞膜破裂,电极内液与细胞内部相接,建立“全细胞记录模式”[9, 13]。
在电压钳模式下,设置钳制电压为-70 mV。当电极内充以Cs+内液(电极内液1),可记录到抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents, IPSCs);当电极内液为K+内液(电极内液2),可记录到兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)。在电流钳模式下,使用电极内液2且钳制电流保持在0 pA时,可以记录到突触前同心圆电极刺激引起的突触后电位(postsynaptic potentials, PSPs)[13]。所有信号都通过Axopatch 200B微电极放大器放大,经由Axon Digidata 1550数模转换器(均购自美国Molecular Devices公司)转换信号,滤波频率为5 kHz,采样频率为10 kHz。通过在电脑上运行的pClamp 10.2记录软件(美国Molecular Devices公司)记录,或用此软件通过数模转换器的数字输出,再经隔离器(Stimulus Isolator A395, 美国WPI公司)给予突触前刺激。
1.5 数据处理与统计学分析EPSCs和IPSCs的反应均以其峰值为测量目标,PSPs以其“线下面积”(area under the curve, AUC)为测量目标[7]。实验结果以x±s表示。统计数据使用GraphPad Prism 6计算,结果处理使用Student’s t-test和双向方差分析(two-way analysis of variance)。
2 结果 2.1 “非饱和浓度”的巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用本部分所有实验均在室温下进行,因此,本实验结果反映的是室温下GABAB受体的反应。首先,我们观察了“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用。0.1 μmol·L-1的非饱和巴氯芬灌流后,可将同心圆电极刺激引起的兴奋性突触后电流(evoked EPSCs, eEPSCs)的幅度由对照组的(106±10)pA降低到(89±11)pA (n=11, P < 0.01)。同样浓度的巴氯芬将同心圆电极刺激引起的抑制性突触后电流(evoked IPSCs, eIPSCs)的幅度由对照组的(142.4±20)pA降低到(103±5)pA (n=10, P < 0.01)。即0.1 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触后电流eEPSCs的抑制率为(14±3)%,而对抑制性突触后电流eIPSCs的抑制率为(26±4)%,两个抑制比率差异有统计学意义(P=0.038), 见Fig 1A、1B。提示低浓度巴氯芬抑制更多的抑制性突触传递。
2.2 “饱和浓度”的巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用其次,我们研究了5 μmol·L-1的“饱和浓度”巴氯芬的作用。将同心圆电极刺激引起的兴奋性突触后电流eEPSCs的幅度由对照组的(106±10)pA降低到(19±3)pA (n=11, P < 0.01)。同样浓度的巴氯芬将同心圆电极刺激引起的抑制性突触后电流eIPSCs的幅度由对照组的(142±20)pA降低到(33±7)pA (n=10, P < 0.01)。平均每个神经元的实验结果,5 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触后电流eEPSCs的抑制率为(80±3)%,对抑制性突触后电流eIPSCs的抑制率为(83±3)%,两个抑制比率差异无统计学意义(P > 0.05)。见Fig 1C。
2.3 “饱和浓度”及“非饱和浓度”的巴氯芬对单个PAG细胞兴奋性的“净作用”上述实验表明,0.1 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触和抑制性突触有不同比例的抑制作用,结果提示,该浓度下的巴氯芬“净作用”可能有兴奋性增加或兴奋性降低两种。最后,为了阐明上述问题,我们研究了单个神经元的兴奋性。形成全细胞记录模式后,对单个PAG神经元进行电流钳制,通过记录电极使得电流始终保持为0,此时可以记录到刺激引起的突触后电位PSPs[7]。如Fig 2所示,突触前刺激电极给予适量的刺激强度可以记录到突触后电位PSPs,给予饱和浓度的巴氯芬(5 μmol·L-1)将动作PSPs的数值由(3.65±0.25)ms·mV降低到(1.53± 0.21)ms·mV (P < 0.01),巴氯芬洗脱后频率恢复到对照组水平(3.53±0.32)ms·mV。而“非饱和浓度”的巴氯芬(0.1 μmol·L-1)将突触后电位PSPs提高到(15.30±2.51)ms·mV,在多数神经元还可能引起动作电位爆发(Fig 2A4)。净作用表示为突触后电位PSPs的AUC,AUC提高代表巴氯芬对突触的影响增加,AUC降低代表对突触的作用降低。以上结果提示,“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂对PAG神经元的兴奋性具有提高作用(Fig 2B)。
3 讨论GABA是PAG内最重要的抑制性递质,GABAB受体也是重要的调节PAG在下行抑制系统功能的受体[1, 5],因为GABAB受体既能抑制兴奋性突触,从而降低PAG神经元的兴奋性,又能抑制抑制性突触,从而增加神经元的兴奋性。因此,GABAB受体的作用十分复杂,而其对兴奋性突触和抑制性突触的“净作用”决定了GABAB受体对PAG输出的调节状态,即如果巴氯芬的净作用是降低了PAG神经元的兴奋性,则降低了下行抑制系统的输出;反之,如果其作用是增强了PAG神经元的兴奋性,则增强了下行抑制系统的输出[7]。这两种结果都影响到自PAG起的下行抑制系统的环路[1-2]。因为PAG的投射有经中缝系统的延髓吻段腹侧部再向脊髓背角投射,也有直接终止于脊髓背角[1-2]。无论是PAG内巴氯芬微量注射[11],还是鞘内给予巴氯芬[14],都能影响实验动物的痛行为学反应,这些可能都是通过GABAB受体的抑制作用和脱抑制作用实现对痛反应的调节。本实验中,我们在突触水平获得的直接证据表明,低浓度的巴氯芬引起了神经元的兴奋作用,这个因素可能是PAG水平GABAB受体引起脊髓水平镇痛效应的基础之一。因为GABA受体在中枢神经系统有复杂的功能[4-5, 15],但巴氯芬在PAG内的作用最终引起脊髓水平的伤害性信息调制结果的解释,还需进一步实验验证[7]。
值得强调的是,因为巴氯芬既能降低兴奋性谷氨酸的释放,降低突触后神经元的兴奋性,同时也能降低GABA的释放,继而通过“去抑制”的方式增加兴奋性,因此某浓度下的巴氯芬净作用可能有兴奋性增加或兴奋性降低两种。为了判断“净作用”是兴奋或抑制,我们在不加谷氨酸受体抑制剂或GABAB受体抑制剂的条件下,记录突触后综合电位PSPs。我们判断净作用的方式是以基线延长线为界,线上面积增加,表示兴奋性增加;线下面积增加,则表示抑制性作用增加。因为兴奋性和抑制性同一时间轴上可以相互抵消,且本实验中主要面积分布在基线延长线以上,因此主要巴氯芬的净作用是对兴奋性的作用。此方法为电生理常用计算方法之一[7]。
需要指出的是,GABAB受体激动剂与受体的结合,与其他受体类似,也有温度依赖性。本实验是在离体薄片室温进行,其实际药代动力学与体温可能存在差别。因此,为了探讨巴氯芬的作用,还需进一步验证其在生理温度(约36 ℃)的作用[16]。另外,GABAB受体及阿片μ受体都是下行抑制系统里的与胞内G蛋白偶联的受体,激活它们可能产生复杂的抑制及脱抑制作用[7, 16]。我们当前的实验结果和前人的部分结果类似,其最终机制可能与受体激动剂的浓度等相关。
( 致谢: 本实验在江苏大学基础医学院解剖教研室实验室完成,感谢解剖教研室姜平教授、欧阳琦副教授的指导及杨鲲实验室同仁的帮助。)
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