2. 山西中医学院中药学院, 山西 晋中 030600
2. Dept of Chinese Medicine, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong Shanxi 030600, China
胃癌(gastric cancer,GC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在东亚尤其高发,据世界卫生组织统计,东亚胃癌发病率和死亡率分别位居世界第2和第3,其中中国占有较大的比例。我国胃癌的死亡率超过世界平均水平的两倍,其高死亡率主要是由于早期诊断困难和缺乏有效的干预手段,将近2/3胃癌患者确诊时已处于晚期,并伴有瘤转移,提高胃癌的诊疗水平,是临床研究者所面临的重大挑战[1-2]。迄今为止,胃癌的发病机制仍不明确,但大量研究表明,其发生和侵袭转移是一个多基因及相关分子共同参与的过程,涉及多种相关癌基因、抑癌基因、信号通路的关键蛋白等。目前,研究较为明确的胃癌相关基因主要有表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)、PTEN、人类端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,hTERT)、Bcl-2、c-myc等。
微小RNAs (microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码单链RNAs,可与靶mRNA 3’-非翻译区(3’-untranslated regions,3’-UTR)互补配对,导致mRNA降解或抑制其翻译,发挥调控基因表达的作用。miRNAs可通过调控细胞增殖、分化、存活、代谢、基因组稳定性、炎症、侵袭等生理过程,影响肿瘤的发展。在关于人类癌症的报道中,其表达水平经常是失调的,扮演着癌基因或抑癌基因的角色[3]。在恶性转移性肿瘤中,miRNAs的表达普遍下调,使肿瘤细胞转移和侵袭相关的趋化因子、受体等蛋白的表达升高、功能增强,促进了肿瘤的发生发展[4]。miRNAs有望单独或联合作为肿瘤的诊断标志物和治疗靶点[5],为寻找更有效的肿瘤诊治手段提供了全新视角。现将近年miRNAs通过调控与胃癌相关基因及蛋白Her-2、PTEN等的表达,参与胃癌发生发展的进展进行综述,旨在为进一步寻找胃癌更为特异、灵敏的诊断标志物和治疗靶点,奠定理论基础。
1 miRNAs对胃癌相关基因及蛋白的调控作用 1.1 miRNAs对Her-2的调控作用Her-2基因是原癌基因,可编码酪氨酸激酶受体,Her-2的活化可诱导胃癌细胞浸润性生长,促进细胞增殖、分化、转移、侵袭、血管再生等,在胃癌的发生、发展中起关键作用。EGF/Her-2轴在包括胃癌在内的多种肿瘤中均处于激活状态,与侵袭性表型和预后不良息息相关[6]。
Liu等[6]发现,胃癌组织中miR-133水平的下调会促进癌细胞生长,进一步机制研究,在人胃癌细胞AGS的Her-2基因3’-UTR植入荧光素酶报告基因质粒,然后通过转染miR-133的模拟物和反义寡核苷酸,观察miR-133对Her-2表达的影响,结果显示:miR-133模拟物可降低Her-2基因表达,而miR-133反义寡核苷酸可升高细胞内Her-2基因水平;同时,过表达miR-133可抑制细胞增殖、促进凋亡,抑制miR-133表达可促进细胞生长、抑制凋亡,说明Her-2基因是miR-133的靶基因。其他学者采用类似的方法,发现Her-2高表达、miR-331-3p低表达与晚期胃癌紧密相关,高水平HOTAIR通过结合miR-331-3p 3’-UTR,间接解除了miR-331-3p对Her-2的抑制作用,参与了胃癌的发生发展[7]。Fassan等[8]在涵盖了胃癌和食道腺癌完整组织学谱的90例活检样本中,发现miR-125a-5p和miR-125b明显低表达,Her-2的表达与miR-125表达呈负相关。PCR实验进一步证实,Her-2低表达和Her-2高表达的胃癌和食道腺癌样本中,miR-125a-5p和miR-125b仍与Her-2的表达呈明显负相关,与前述结果一致。说明miR-125a-5p和miR-125b可调控Her-2的表达,Her-2为miR-125的靶基因。miRNAs通过调控癌基因Her-2的表达,参与了胃癌进展,提示我们可以通过检测相应miRNAs水平或调整其水平,为胃癌诊断和治疗提供参考依据。上述研究虽显示在肿瘤形成级联反应中,癌基因Her-2表达是失调的,但导致Her-2蛋白上调的机制仍不清楚,需要更多的深入研究[8]。
1.2 miRNAs对PTEN的调控作用定位于人类染色体10q23的PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因,能够抑制肿瘤细胞增殖、转移和浸润,还可通过调控相关信号通路,参与血管生成,该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。近期研究表明,PTEN在人类胃癌中是低表达或不表达的,其低表达能够使胃癌患者对多种化疗药物产生抗性[9-10]。
miR-214被发现在胃癌组织和细胞株中过表达,且miR-214的表达水平与胃癌的进展以及预后不良紧密相关。同时,在肿瘤组织中,miR-214水平和PTEN的表达呈明显负相关,即miR-214通过靶向PTEN基因的3’-UTR,在转录后水平负向调控PTEN的表达。PTEN与癌细胞的转移和浸润等密切相关,所以推测miR-214可通过抑制PTEN的表达,参与胃癌的发生、发展[9]。依赖于炎症因子IL-1β激活的核因子NF-κB,可以促进miR-425的上调,上调的miR-425再通过靶向PTEN,来促进胃癌细胞的生长[11]。Shi等[12]在胃癌细胞和肿瘤样本中发现,miR-221-3p明显高表达,进一步机制研究揭示,miR-221-3p可能是通过抑制靶基因PTEN的表达,发挥致瘤特性。
Wang等[10]对miR-19a/b在耐药胃癌细胞株中的作用机制进行了研究,发现miR-19a/b表达的上调,可降低胃癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。机制研究发现,miR-19a/b除了可以通过上调MDR1和P-gp蛋白的水平,加速胃癌细胞中阿霉素的主动外排,同时可通过调控Bcl-2和Bax的表达,来拮抗药物诱导的细胞凋亡作用。Western blot结果显示,在转染miR-19a/b的SGC-7901细胞中,PTEN表达下调,Akt表达上升,提示miR-19a/b可通过调节PTEN-Akt信号通路,增加药物的排出,降低细胞对药物的敏感性。研究最终证实了PTEN是miR-19a/b功能性的靶标,miR-19a/b可抑制PTEN的表达,参与胃癌多药耐药性的形成。此外,还有其他研究发现多个miRNAs可通过直接靶向PTEN,调控PTEN的表达,在胃癌耐药等方面发挥重要作用。如Yang等[13]证实了miR-21通过调控PTEN的表达,使胃癌患者对顺铂治疗抗性增强。因此,PTEN基因的生物治疗将会为耐药的肿瘤患者带来福音,可能为肿瘤的治疗提供新的途径。
1.3 miRNAs对hTERT的调控作用hTERT决定了端粒酶的活性,能够逆转端粒缩短。当正常增殖的细胞进入凋亡和坏死阶段时,hTERT表达会逐渐降低,此时细胞停止增殖。然而,高表达的hTERT以及端粒酶的激活都会导致肿瘤细胞无限增殖。hTERT在肿瘤形成、癌细胞生长、转移和浸润方面发挥了重要作用[14]。
Zhang等[15]发现,miR-1182通过结合hTERT基因的开放阅读框,调控hTERT的表达,进而抑制了胃癌细胞的增殖和转移。尚有miR-1207-5p和miR-1266通过直接结合于靶基因hTERT 3’-UTR, 抑制了胃癌细胞的生长和浸润的相关研究[14]。竞争性内源RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)是一种全新的基因表达调控模式,是RNAs的一种作用方式。细胞内存在一类内源性RNAs,由于3’-UTR含有与miRNA靶mRNA 3’-UTR相似的miRNAs反应原件(miRNAs response elements,MREs),可以竞争性结合相同的miRNAs,进而调节各自的表达水平[1]。Lü等[16]近期研究结果表明,长链非编码RNA BC032469作为竞争性内源RNA,竞争结合miR-1207-5p,从而消除了miR-1207-5p对靶基因hTERT的抑制作用,促进了胃癌细胞增殖。
1.4 miRNAs对Bcl-2的调控作用Bcl-2家族蛋白是一类凋亡进程的重要调节因子,可调控细胞色素C释放及caspases级联反应,最终影响凋亡发生。Bcl-2蛋白作为细胞凋亡的抑制基因,在caspases级联放大与线粒体之间扮演着“桥梁”的作用。在多种人源肿瘤细胞株中可观察到Bcl-2过表达,而在分化细胞或将凋亡细胞中表达量很低或不表达。
Zhu等[17]研究了胃癌样本中miR-429和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,并分析了二者表达水平的相关性。结果显示,与癌旁组织相比,miR-429水平在胃癌样本中明显降低,Bcl-2蛋白水平明显升高,两者呈明显的负相关,进一步的荧光素酶报告基因法显示,miR-429调控了Bcl-2的表达。此外,下调miR-429可阻断5-氟尿嘧啶(5-FU)处理导致的胃癌细胞AGS活力下降和凋亡增加,而上调miR-429可与5-FU的抗肿瘤作用产生协同效应。由此我们推测,过表达miR-429可作为胃癌的潜在治疗靶标,通过增加其表达可辅助化疗药物诱导细胞凋亡。有研究报道[18],miR-449a通过抑制靶基因Bcl-2的表达,促进人类胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901凋亡。
Sacconi等[19]发现,miR-204在胃癌和癌旁组织样本中表达水平存在明显差异,进一步研究发现,miR-204靶向抑制Bcl-2 mRNA的表达,可以增强胃癌细胞对顺铂和奥沙利铂等抗癌药物的反应性;miR-204异位表达可抑制细胞集落形成、迁移和浸润。最新研究显示[20],胃癌细胞SGC-7901中,miR-449a表达水平明显低于正常的胃上皮细胞GES-1,同样,miR-449a在胃癌组织中的表达也明显低于癌旁组织。MTT实验结果表明,上调miR-449a水平抑制了SGC-7901细胞的增殖;流式细胞术检测发现,miR-449a异位表达可降低S期细胞百分率,同时增加G1/G0期细胞比率,并与顺铂诱导的胃癌细胞凋亡作用相协同;进一步的机制研究表明,miR-449a可能是通过抑制Bcl-2和cyclin D1表达,在胃癌中发挥抑癌作用,同时增强胃癌对化疗的敏感性。miRNAs对癌基因Bcl-2表达的抑制作用,提示我们可以从调节miRNAs表达角度来考虑对胃癌的防治策略。除上述miRNAs之外,Bcl-2还可以受到miR-190b等多种miRNAs的转录后调控,影响细胞凋亡,在胃癌细胞化疗抗性形成过程中发挥重要作用。
1.5 miRNAs对c-myc的调控作用c-myc作为一种癌基因,广泛参与了细胞迁移、生长、增殖等多个生理过程,在人类多种肿瘤中过表达。最新研究显示,c-myc在胃癌进展中发挥着促癌作用,其过表达与胃癌晚期、淋巴结转移、低存活率紧密相关[21]。
miR-155被发现在胃癌组织和胃癌细胞株SGC-7901中明显低表达,而高水平的miR-155可明显抑制肿瘤细胞的活力、增殖以及黏附。进一步研究显示,miR-155可通过直接结合c-myc基因的3’-UTR,抑制其表达,在胃癌进程中发挥一定作用[22]。Qian等[21]采用生物信息学分析手段,预测c-myc可能是miR-561的靶基因,采用荧光素酶报告基因法进一步验证,结果显示miR-561通过直接结合c-myc 3’-UTR,抑制其表达;恢复c-myc在胃癌细胞中的表达,会扭转miR-561对其表达的抑制作用。miR-561通过抑制靶标c-myc的表达,抑制了胃癌细胞的增殖和浸润,说明miR-561有作为肿瘤抑制因子的潜质。基因上游CpG岛高甲基化常常导致抑癌miRNAs下调,Yin等[23]在miR-33b低表达的胃癌细胞中,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR),发现miR-33b基因上游的CpG岛甲基化水平有所升高。进一步通过转染、免疫印迹等方法发现,抑癌miR-33b和c-myc在胃癌细胞和样本中表达呈负相关,研究结果表明miR-33b可能是通过靶标c-myc的表达,抑制了肿瘤的转移、浸润和增殖。研究表明[2],let-7b也可通过下调c-myc,增强顺铂和长春新碱耐药的SGC-7901对化疗药物的敏感性。
1.6 其他除了前述公认的参与胃癌发生发展进程基因外,miRNAs还可通过调控其他基因的表达,参与胃癌发生、发展以及肿瘤对化疗药物的多药耐药。miR-139通过调控靶基因C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)的表达,参与Her-2信号通路,促进胃癌进展和转移[4]。在研究miR-219-2-3p对胃癌抑癌机制时,金锦莲等[24]发现,胃癌细胞株中miR-219-2-3p可能是通过下调ERK信号通路的活性,从而产生对胃癌细胞的抑制作用。膜受体配体JAG1在多种肿瘤中高表达,且与预后存活率低密切相关。韦尉元等[25]在预测miR-1284可能的下游靶基因的基础上,进一步探讨了miR-1284与胃癌的相关性及分子机制,结果显示,miR-1284可能通过调控靶基因JAG1,发挥抑制胃癌发生、发展的作用。
2 小结虽然近年来胃癌诊断方法和外科治疗技术不断提高,但晚期胃癌患者的预后仍不理想。因此,探寻特异、灵敏的生物学标志物,尽早明确诊断和选择治疗方式,对于提高胃癌患者的生存率具有重要意义。近期研究较热的非编码miRNAs在许多疾病和癌症中表达失调,失调的miRNAs会影响大多数的癌症特征,具体了解miRNAs是如何影响癌症相关生物过程,其定量分析会对癌症的诊断、治疗和预后有很大参考价值。未来能将miRNAs用于胃癌诊断标志物和治疗靶点不失为一个好方向。
目前对miRNAs作为诊断标志物的研究尚处于探索阶段,所检测到的病例数有限,文中提及可能参与胃癌发生机制的miRNAs(Fig 1)指标是否是胃癌所特异的?尤其在不同分期胃癌患者体内表达,是否具有临床参考价值?这些问题的解决尚需投入更多的临床研究。目前,已有关于多个miRNAs联合起来组成的miRNAs循环分子标记物表达谱在结肠癌诊断方面的研究[4]。相信随着对miRNAs研究不断深入,miRNAs单独或联合作为肿瘤诊治评估的重要指标,在未来有望应用于临床。
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