2. 重庆市高校中药新药筛选重点实验室,重庆 400715;
3. 国家中医药管理局中药药理学重点建设学科,重庆 400715;
4. 重庆市北碚区中医院内科,重庆 400715
2. Chongqing Key Lab of New Drug Screening from Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400715, China;
3. Pharmacology of Chinese Materia Medica-the Key Discipline Constructed by the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400715, China;
4. Internal Medicine of Chongqing Beibei Hospital of TCM, Chongqing 400715, China
中医理论认为,血是记忆之本。缺铁性贫血是最常见的一种贫血,在经济不发达地区的婴幼儿、育龄妇女高发。脑组织在发生铁缺乏后,组织供氧量降低,海马区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达减少,与其受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B,TrkB)的结合减少,其下游的Ca2+/CaM/CaMK和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein,CREB)表达减少,导致突触可塑性降低,引起神经元凋亡[1],造成记忆力减退等问题。缺铁性贫血属于中医血虚的范畴,四物汤是补血经典方剂。课题组前期的研究表明其对缺铁性贫血幼鼠的体质和铁代谢具有一定的改善作用[2],但对缺铁性贫血幼鼠学习记忆是否有影响尚未见报道。本研究观察了四物汤对缺铁性贫血幼鼠学习记忆能力的改善作用及其对BDNF-TrkB-CREB通路的影响,为进一步将四物汤作为用于治疗缺铁性贫血的药物提供理论依据。
1 材料 1.1 实验动物60只SPF级21 d断乳SD大鼠,♀♂各半,购自重庆市中药研究院[SCXK(渝)2012-0006],饲养于西南大学药学院实验动物中心。
1.2 药物与试剂四物汤饮片(重庆鑫斛药荘);琥珀酸亚铁片(四川奥邦);AIN-93G标准和低铁饲料(南通特洛菲);兔源BDNF、TrkB、β-tubulin抗体(武汉三鹰);兔源CaMKⅡα、CREB-1抗体(北京博奥森)。
1.3 仪器新物体识别系统(实验室自制);MT-200型Morris水迷宫(成都泰盟);Elx800型酶标仪(美国Bio Tek公司);153BR56326型电泳仪(伯乐生命医学);Tanon 5200R型化学发光图像分析系统(上海天能)。
2 方法 2.1 造模分组与给药将21 d断乳大鼠随机分为正常组和造模组。正常组饲喂标准饲料,造模组饲喂低铁饲料,2周后测定血常规,以每只大鼠血红蛋白含量和体质量均低于正常组均值判定造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、琥珀酸亚铁组(50 mg·kg-1)、四物汤组(4、8、16 g·kg-1),其中四物汤8 g·kg-1组由临床人用剂量换算所得。统计大鼠血红蛋白含量和体质量,确保各造模组大鼠组间差异无显著性。除正常组和模型组灌胃等体积水外,其余4组分别灌胃设定剂量的琥珀酸亚铁或四物汤水煎液,连续灌胃给药4周,每天1次。给药期间,各组大鼠继续饲喂标准或低铁饲料。给药结束后进行行为学和蛋白表达的测定。
2.2 大鼠识别记忆能力的测定[3]实验共进行3 d。d 1将动物放在实验箱内自由活动10 min。d 2将两个完全相同的物体A和B放在实验箱内,记录大鼠10 min内与A和B接触的情况。d 3用另一完全不同的物体C替换B,记录大鼠10 min内与A和C接触的情况。大鼠对新、旧物体的探究时间分别记为Tn和Tf。大鼠分辨指数/%=Tn/(Tn+Tf)×100%。
2.3 大鼠空间记忆能力的测定[4]测定使用Morris水迷宫进行。实验共进行5 d。d 1~4为定位航行,统计各组大鼠找到平台的时间为逃避潜伏期。d 5为空间探索,观察60 s内游泳的路径。
2.4 组织样本制备和蛋白表达的测定各组大鼠禁食不禁水12 h。麻醉后,冰上分离海马,BCA测定组织总蛋白含量,制备电泳上样样品。制备12% SDS-PAGE凝胶,加样后,110 V进行电泳。经过转膜,封闭,孵育一抗、二抗后,显色分析。
2.5 统计学处理实验数据采用SPSS统计软件进行单因素方差分析,以x±s表示各指标的平均值和离散程度。
3 结果 3.1 四物汤明显改善贫血大鼠幼鼠的识别记忆能力与正常组相比,模型组的分辨指数明显降低(P < 0.05)。与模型组相比,四物汤各组的分辨指数均明显升高(P < 0.05,P < 0.01),见Tab 1。
Group | Discrimination index | Time rats swam in the correspond quadrant/s | Distance rats swam in the correspond quadrant/cm |
Control | 0.55±0.06 | 12.96±3.61 | 588.80±143.40 |
Model | 0.30±0.05# | 9.22±2.88# | 441.41±134.10# |
Ferrous succinate 50 mg·kg-1 | 0.61±0.02** | 14.16±4.49** | 587.72±148.30* |
SWD 4 g·kg-1 | 0.49±0.01** | 13.02±4.84* | 514.88±173.32 |
SWD 8 g·kg-1 | 0.65±0.01** | 13.91±5.77* | 589.98±171.18* |
SWD 16 g·kg-1 | 0.51±0.02* | 16.40±5.01** | 650.32±165.45** |
#P < 0.05 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
定位航行中,与正常组相比,模型组d 2的逃避潜伏期明显延长(P < 0.01)。与模型组相比,四物汤组(8、16 g·kg-1)d 2的逃避潜伏期明显缩短(P < 0.05,P < 0.01)。空间探索中,与正常组相比,模型组在平台所在象限游泳的时间和距离明显缩短(P < 0.05);与模型组相比,四物汤各组在平台所在象限游泳的时间明显延长(P < 0.05,P < 0.01),四物汤组(8、16 g·kg-1)在平台所在象限游泳的距离明显延长(P < 0.05,P < 0.01),见Tab 1。
3.3 四物汤明显改善贫血大鼠幼鼠海马区BDNF及相关通路蛋白的表达与正常组相比,模型组海马区BDNF、TrkB、CaMKⅡα和CREB-1的表达明显降低(P < 0.01)。与模型组相比,四物汤4 g·kg-1组海马区的TrkB表达明显升高(P < 0.01),四物汤8 g·kg-1组海马区的BDNF、TrkB和CREB-1表达明显升高(P < 0.01),四物汤16 g·kg-1组海马区的BDNF、TrkB、CaMKⅡα和CREB-1表达明显升高(P < 0.05,P < 0.01)。
4 讨论铁缺乏会损害运动神经中枢和海马依赖性的跟踪调节能力,导致学习记忆能力的受损[5]。本研究采用21 d断乳大鼠作为实验对象,通过饲喂低铁饲料成功复制缺铁性贫血幼鼠模型,其学习记忆能力较正常组相比明显降低。
新物体识别是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法[6],主要用于检测海马依赖的非空间学习记忆能力。Morris水迷宫能够较为准确地反映实验动物以视觉为基础的空间学习、记忆、定向及定位能力的变化[7],主要用于检测海马依赖的空间学习记忆能力。四物汤可以明显改善缺铁性贫血幼鼠的识别记忆能力和空间记忆能力,但呈非剂量依赖性,推测其可能会影响非海马依赖的学习记忆能力。BDNF对树突形成、神经元的维持及存活,突触可塑性以及完整性中具有重要的作用[8]。四物汤改善缺铁性贫血幼鼠学习记忆的能力的机制,可能与其上调海马区BDNF-TrkB-CREB通路的表达有关,并可能影响其他通路蛋白的表达。
本研究证实了四物汤对缺铁性贫血大鼠学习记忆能力的改善作用。但在未来的研究中,还需要了解四物汤改善铁缺乏导致学习记忆能力降低更进一步的机制。
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