2. 昆明医科大学附属延安医院 呼吸内一科，云南 昆明 650051;
3. 昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科，云南 昆明 650032
2. First Dept of Respiratory Medicine, Yan'an Hospital Affiliated to Kunming Medical University, Kunming 650051, China;
3. First Dept of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由于肺血管收缩反应性增强及肺血管结构重建，最终引起肺动脉压力升高为特征的一组病理生理综合征[1-2]。其中，由肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖、迁移所引起的肺血管结构重建，是PAH形成的中心环节[3-5]。重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，主要成分重楼皂苷具有抗肿瘤、止血、抗炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化等功效[6-7]。其中，抗炎及抑制血管生成的作用可能会对PAH的防治起一定作用。该文主要研究重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ, PPⅦ)对内皮素-1(endothilin-1，ET-1)诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移的作用。
1 材料 1.1 试剂重楼皂苷Ⅶ，纯度≥98%(索莱宝公司)；ET-1(Sigma公司)；DMEM高糖培养液、胎牛血清(BI公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)；细胞周期检测试剂盒(Beckman公司)。
1.2 实验动物SPF级，♂，Sprague-Dawley(SD)大鼠，6~8周龄，购自昆明医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(滇)k2015-0002。
2 方法 2.1 PASMCs的原代分离、培养与鉴定采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠PASMCs，抗α-actin和α-SMA免疫组化染色鉴定。
2.2 实验分组实验分组：①对照组：正常培养细胞；②ET-1组：对照组中加入10-7 mol·L-1 ET-1；③给药组：ET-1+PPⅦ (0.25、0.5、0.75 μmol·L-1)。分别于24、48、72 h收获细胞，检测各项指标。
2.3 检测指标采用CCK-8法，筛选ET-1诱导大鼠PASMCs增殖的最佳浓度，同时按照“2.2”项分组，确定PPⅦ抑制PASMCs增殖的最佳浓度。使用Transwell迁移小室，检测细胞的迁移能力。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测PPⅦ处理大鼠PASMCs后凋亡情况。通过流式细胞术检测细胞周期的变化。
2.4 统计学处理采用SPSS Statistics v20软件分析数据，数据均用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
3 结果 3.1 PASMCs的鉴定结果倒置显微镜下，大鼠PASMCs呈“谷”、“峰”状生长，特异性兔抗鼠α-actin和α-SMA单克隆抗体免疫荧光鉴定可见排列的束状肌丝被染色，证明培养细胞为平滑肌细胞。
3.2 PPⅦ抑制PASMCs增殖诱导大鼠PAMCs增殖的最佳ET-1浓度为10-7 mol·L-1。Tab 1结果显示，PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)浓度依赖性抑制ET-1诱导的PASMCs增殖(P < 0.01)。
| Group | Concentration/μmol·L-1 | OD value | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | ||
| Control | - | 0.39±0.04 | 0.68±0.02 | 0.74±0.01 |
| ET-1 | - | 0.48±0.01** | 0.84±0.03** | 0.99±0.03** |
| PPⅦ | 0.25 | 0.45±0.01** | 0.76±0.01**## | 0.87±0.05**## |
| 0.50 | 0.37±0.00## | 0.69±0.03## | 0.74±0.01## | |
| 0.75 | 0.34±0.02*## | 0.61±0.03*## | 0.67±0.04*## | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs ET-1 | ||||
Transwell结果显示(Tab 2)，ET-1处理后，大鼠PASMCs迁移率明显增加(P < 0.01)。经PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)处理后，与ET-1组相比，PASMCs迁移率明显下降(P < 0.01)，随时间和PPⅦ浓度的增加，PPⅦ抑制PASMCs迁移率越明显。
| Group | Concentration/μmol·L-1 | Average cells/field | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | ||
| Control | - | 22.60±2.88 | 37.60±7.06 | 52.20±11.67 |
| ET-1 | - | 29.40±2.79** | 52.80±1.48** | 73.00±3.54** |
| PPⅦ | 0.25 | 27.00±4.64** | 46.40±5.86** | 68.20±4.76** |
| 0.50 | 22.60±2.70## | 37.20±5.12## | 52.00±3.39## | |
| 0.75 | 16.40±2.70*## | 31.80±2.59## | 42.40±2.61*## | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs ET-1 | ||||
ET-1处理大鼠PASMCs后，G0/G1期细胞比例较对照组明显减少(P < 0.01)，S期和G2/M细胞比例较对照组明显增加(P < 0.05)，G2/M期细胞比例较对照组差异无显著性。ET-1诱导的大鼠PASMCs经PPⅦ处理后，G0/G1期细胞比例明显增加(P < 0.01)，与对照组相比差异无显著性；S期细胞较ET-1组降低(P < 0.01)，与对照组相比差异无显著性；G2/M期细胞比例较对照组无明显差异，较ET-1组降低(P < 0.05)。PPⅦ对大鼠PASMCs细胞周期的影响结果显示，用0.5 mol·L-1 PPⅦ处理细胞48 h，抑制了ET-1诱导的PASMCs G0/G1期向S期的转化，抑制了S期向G2/M期的转化。
3.5 细胞凋亡分析Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果显示，与对照组比较，ET-1处理大鼠PASMCs 48 h后，晚期凋亡细胞比例明显降低(P < 0.01)，死亡细胞比例降低(P < 0.05)。经PPⅦ 0.5 μmol·L-1处理48 h后，与ET-1组相比，PASMCs细胞总凋亡率明显升高(P < 0.01)，正常细胞比例明显降低(P < 0.01)。
4 讨论PAH是临床众多心、肺疾病发生发展过程中重要的病理生理环节，研究表明PAH的发生机制复杂，PASMCs的异常增殖和迁移是PAH的主要发病机制。本文主要研究云南道地药材滇重楼中主要成分PPⅦ对ET-1诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移的影响。结果显示，PPⅦ呈时间和浓度依赖性抑制ET-1诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移。采用流式细胞仪检测PPⅦ处理后大鼠PASMCs细胞凋亡和细胞周期情况，发现PPⅦ处理后，PASMCs早期凋亡率和总凋亡率均明显升高，表明PPⅦ可通过诱导细胞凋亡，抑制ET-1诱导的G0/G1期向S期的转化，抑制S期向G2/M期的转化。实验结果为进一步深入研究PPⅦ在PAH防治中的作用及机制提供了实验依据。
( 致谢: 本实验是在昆明市延安医院中心实验室完成，感谢对实验给予帮助的老师和同学! )
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