2. 河北北方学院 附属第一医院消化内科，河北 张家口 075000;
3. 河北北方学院 生命科学研究中心，河北 张家口 075000
2. Digestion Dept, 1st Affiliated Hospital, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China;
3. Life Science Research Centre of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
我国食管癌患者就医时多处于疾病的中晚期，患者的总体5年生存率 < 20% [1]。化疗是中晚期食管癌的主要有效治疗措施之一。临床研究发现，在化疗过程中，部分患者会对化疗药物产生多药耐药性(multi-drug resistance, MDR)，MDR严重影响了临床治疗效果和患者预后[2]。因此，寻找安全有效的MDR逆转药物，并探讨其作用机制具有重要的临床意义。
姜黄素(curcumin, Cur)是一种植物多酚，主要来源于姜黄属植物的根茎中，是中药姜黄的主要活性成分。实验表明，Cur对肺癌、卵巢癌等多种肿瘤MDR具有逆转作用[3-4]。但Cur逆转MDR的作用机制仍不清楚。Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移及预后不良有关，其中Wnt2尤其与消化道肿瘤密切相关，但Wnt2/β-catenin信号通路与食管癌MDR逆转作用是否有关鲜有报道。本研究拟以耐长春新碱(vincristine, VCR)的食管癌Eca-109/VCR细胞株为研究对象，采用qPCR、Western blot、流式细胞术等方法，探讨Cur对食管癌MDR的逆转作用及其可能的机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人食管癌耐药细胞株(Eca-109/VCR)购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.1.2 试剂Cur购自美国Cayman公司；VCR、RPMI 1640不完全培养液，购自南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒购自美国BD公司；P-gp ELISA试剂盒购自武汉基因美科技有限公司；总RNA提取及反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；引物由宝生物工程(大连)有限公司合成；CCK-8试剂盒、化学发光试剂、细胞裂解液，均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人Wnt2、β-catenin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein 2，MMP-2)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)的多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.1.3 仪器BB16HF二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；Stat Fax-210全自动酶联免疫酶标仪(美国Awareness公司)；FACS AriaⅡ流式细胞仪(美国BD公司)；ABI PRISM 7300型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪(美国GE公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养Eca-109/VCR细胞使用含10%胎牛血清的培养液，并将细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，每天更换培养液，每2~3 d传代1次。培养液中加入2.0 mg·L-1 VCR维持细胞耐药性，实验前撤药培养1周，并选取对数生长期细胞进行后续实验。实验设对照组、Cur单药组(Cur组)、VCR单药组(VCR组)、Cur与VCR联合用药组(Cur+VCR组)。
1.2.2 Cur对Eca-109/VCR的增殖抑制率检测取对数生长期的Eca-109/VCR细胞制成单细胞细胞悬液，并将浓度调整为1×108·L-1，接种于96孔板，每孔200 μL，贴壁培养24 h后，分别加入终浓度为10、20、40、80、160 μmol·L-1的Cur，阴性对照组加入含0 μmol·L-1 Cur的培养液，空白对照组为不含细胞和药物的培养液，每个浓度均设3个复孔，培养24 h。向每孔加入20 μL CCK-8液后，继续培养4 h，通过全自动酶联免疫酶标仪检测波长为490 nm处的吸光度(A)值，各组分别取平均值，计算细胞生长抑制率：抑制率=[1-(处理组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)]×100%。选取抑制率＜10%的Cur最大浓度(20 μmol·L-1)作为逆转剂量，用于后续实验。
1.2.3 Cur对Eca-109/VCR细胞的逆转效应检测将对数生长期的Eca-109/VCR细胞制备成浓度为5×107·L-1的细胞悬液，每孔200 μL，接种于96孔板，培养24 h，贴壁后弃掉旧培养液。阴性对照组加入不含药物的培养液，空白对照组为不含细胞和药物的阴性培养液。VCR单药组分别加入终浓度为1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1的VCR，Cur + VCR组分别加入20 μmol·L-1 Cur与1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1的VCR，每组设3个复孔，继续培养24 h后，每孔加入CCK-8液20 μL，继续培养4 h，然后用酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)值。计算细胞抑制率：抑制率/%=[1-(处理组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)]×100%。计算半数抑制浓度(IC50)及逆转倍数(reversal fold，RF)：RF=耐药细胞IC50/逆转细胞IC50。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡将对数生长期的Eca-109/VCR细胞制成浓度为1×108·L-1的细胞悬液，并接种于4个50 mL的培养瓶中，使用不含胎牛血清的培养液培养12 h，待细胞贴壁后加药，Cur组加入20 μmol·L-1 Cur，VCR组加入2.0 mg·L-1 VCR，Cur + VCR组加入20 μmol·L-1 Cur与2.0 mg·L-1 VCR。作用24 h后，消化离心，收集细胞，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的操作流程处理细胞，并在1 h内使用流式细胞仪分析细胞的凋亡百分率。
1.2.5 ELISA检测P-gp蛋白表达将对数生长期的Eca-109/VCR细胞制成单细胞悬液，并调整其浓度为1×108·L-1，接种于细胞培养瓶贴壁培养。待细胞贴壁生长后，分别用20 μmol·L-1 Cur、2.0 mg·L-1 VCR单独或联合作用24 h。24 h后收集细胞，用PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到1×109·L-1左右，反复冻融，使细胞破坏并释放出细胞内成分。2 000~3 000 r·min-1离心20 min，收集上清。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤，制作标准曲线并测定P-gp的含量。
1.2.6 qPCR检测Wnt2、β-catenin mRNA的表达取对数生长期的Eca-109/VCR细胞。实验组分别加入20 μmol·L-1 Cur、2.0 mg·L-1 VCR、20 μmol·L-1 Cur联合2.0 mg·L-1 VCR，对照组加入不含任何药物的培养液，作用24 h后，分别收集各组细胞，提取总RNA，重复3次，选取A260 nm/A280 nm比值在1.8~2.0的RNA标本，按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒提供的操作步骤进行反转录，合成cDNA。以此cDNA为模板，采用SYBR GreenⅠ两步法进行PCR扩增，并检测Wnt2、β-catenin mRNA的表达水平，以β-actin为内参照。Wnt2上游引物序列为5’-GCCGAGTGGACAGCAGAATG-3’，下游引物序列为5’-AAACAAAGGCAGATTCCCGACTA-3’，扩增产物片段为127 bp；β-catenin上游引物序列为5’-GAATGTCTGAGGACAAGCCACAAG-3’，下游引物序列为5’-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3’，扩增产物片段为127 bp；β-actin上游引物序列为5’-TGGCACCCGCACAATGAA-3’，下游引物序列为5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，扩增产物片段为186 bp。采集、分析各组Wnt2、β-catenin mRNA的相对表达量，以2-ΔΔCt值表示。设对照组的相对表达量为100%，分别计算各实验组Wnt2、β-catenin mRNA的相对表达率。
1.2.7 Western blot检测Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白的表达取对数生长期的Eca-109/VCR细胞，接种于细胞培养瓶中，贴壁培养。实验组分别加入20 μmol·L-1 Cur、2.0 mg·L-1 VCR、20 μmol·L-1 Cur联合2.0 mg·L-1 VCR。作用24 h后，提取各组Eca-109/VCR细胞总蛋白，各组取等量蛋白提取液，分别加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，湿法转膜至PVDF膜上，用质量浓度为50 g·L-1的脱脂奶粉封闭1 h后，加入抗Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1(1 :500)一抗，4℃孵育过夜，洗膜后，加入相应二抗(1 :10 000)室温反应2 h，再次洗膜，加入ECL化学发光液，使用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪检测蛋白条带，实验以β-actin校正作相对量分析，实验重复3次，取平均值。
1.3 统计学方法所有实验数据均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。所有数据采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学处理。
2 结果 2.1 Cur对Eca-109/VCR细胞增殖抑制率的影响如Fig 1所示，Cur(10、20、40、80、160 μmol·L-1)作用于Eca-109/VCR细胞24 h后，细胞增殖抑制率随着Cur的浓度增加而明显升高，呈剂量依赖性，且当Cur≤20 μmol·L-1时，细胞增殖抑制率均小于10%，故选取对食管癌细胞株Eca-109/VCR抑制率＜10%的最大姜黄素浓度，即20 μmol·L-1的Cur，作为逆转剂量用于后续实验。
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| Fig 1 The inhibitory rate of Eca-109/VCR cell line treated with curcumin for 24 h(x±s, n=3) *P < 0.05 vs 0 μmol·L-1 |
如Fig 2所示，不同浓度VCR单药或与Cur(20 μmol·L-1)联合作用24 h后，各Cur+VCR组对Eca-109/VCR细胞的增殖抑制率较相应VCR组明显升高(P < 0.01)，说明20 μmol·L-1 Cur能明显增加不同浓度VCR对Eca-109/VCR的抑制作用，且浓度为20 μmol·L-1 Cur与2.0 mg·L-1 VCR联合作用后，对细胞的抑制作用增加幅度最大，达40.39%。此外，VCR组与Cur+VCR组的IC50分别为5.13、1.47 mg·L-1，逆转倍数为3.49。
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| Fig 2 The reversal effect of curcumin on Eca-109/VCR cell line(x±s, n=3) **P < 0.01 vs the same concentration of VCR |
如Fig 3所示，Cur(20 μmol·L-1)和VCR(2.0 mg·L-1)单药或联合作用24 h后，对照组、Cur组和VCR组的细胞凋亡率分别为(1.37±0.30) %、(8.50±0.84)%、(9.87±0.89)%，而Cur+VCR组的细胞凋亡率为(18.46 ± 2.38)%，可见联合组的细胞凋亡率明显高于两单药组及对照组(P < 0.05)。
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| Fig 3 The apoptosis rate of Eca-109/VCR cell line treated by single Cur, VCR or their combination for 24 h(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs the same concentration of VCR |
如Fig 4所示，Cur+VCR组的P-gp蛋白含量明显低于VCR组及对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effects on protein expression of P-gp in Eca-109/VCR cells treated with Cur and VCR alone or their combination for 24 h(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs the same concentration of VCR |
如Fig 5所示，与对照组相比，各用药组Wnt2、β-catenin mRNA的表达均降低(P < 0.05)，且Cur+VCR组Wnt2、β-catenin mRNA的表达均较VCR组明显降低(P < 0.05)。
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| Fig 5 The relative expression level of Wnt2 and β-catenin mRNA in Eca-109/VCR cells treated with Cur and VCR alone or their combination for 24 h(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs the same concentration of VCR |
如Fig 6所示，Cur(20 μmol·L-1)和VCR(2.0 mg·L-1)单药或联合作用24 h后，与对照组相比，除Cur组Wnt2蛋白表达差异无统计学意义外，其余各用药组Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白表达均降低(P < 0.05)，且Cur+VCR组Wnt2、β-catenin、MMP-2、HMGB1蛋白的表达均较VCR单药组明显降低(P < 0.01)。
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| Fig 6 Effects on protein expression of Wnt2, β-catenin, MMP-2 and HMGB1 in Eca-109/VCR cells treated with Cur and VCR alone or their combination for 24 h(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control; ##P < 0.01 vs the same concentration of VCR |
我国食管癌具有高发病率、高死亡率、预后较差等特点。在临床食管癌化疗过程中产生的多药耐药现象，严重地影响了中晚期食管癌患者的治疗效果[5]。肿瘤多药耐药形成的机制比较复杂，包括转运蛋白介导的多药耐药、酶系统介导的多药耐药、凋亡基因介导的多药耐药等。90%以上肿瘤患者的死亡原因都与不同程度的化疗耐药密切相关。因此，寻找高效、低毒副作用的多药耐药逆转药物，并探讨其可能的逆转机制已成为近年来的研究热点。
Cur是姜黄中的一种天然、低毒、价廉的酚类色素，研究表明，其可通过不同途径逆转肿瘤的耐药性[6-7]。本研究发现，Cur对食管癌耐长春新碱Eca-109/VCR细胞具有明显的生长抑制作用，其细胞增殖抑制率随着Cur浓度增加而明显升高，且小剂量Cur(20 μmol·L-1)与VCR(2.0 mg·L-1)联合作用24 h后，对Eca-109/VCR细胞MDR的逆转倍数为3.49。此外，Cur与VCR联合作用24 h，P-gp蛋白的表达较VCR组明显降低，细胞凋亡率较VCR组明显升高。结果提示，小剂量Cur可能通过下调P-gp的表达，逆转Eca-109/VCR细胞的耐药性，提高其对VCR的敏感性。
Wnt2基因是Wnt家族成员之一。Wnt信号通路与多种肿瘤的发生、发展及多药耐药性密切相关[8-11]。Wnt2 mRNA在人胎肺、胎肾及胎盘中均有表达，但在正常成人的胃肠道没有表达。Wnt2通常激活经典的Wnt/β-catenin信号通路，Wnt2存在时，与卷曲蛋白1(FZD1)结合后，使得由Axin、GSK-3β、APC组成的分解复合体解聚，影响β-catenin的正常降解，导致其在胞质中不断积累，最终进入胞核，激活Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因分为间接靶基因与直接靶基因。后者因启动子区大多含有DNA顺式作用元件5′-A/TA/TCAAAG-3′，可与β-catenin/TCF复合体结合并进行基因转录，而MDR1就是一个直接靶基因。通过降低Wnt/β-catenin信号通路活性后，可下调MDR1/P-gp的表达，逆转乳腺癌耐药细胞的多药耐药性[12]。本研究发现，小剂量Cur与VCR联合作用后，在基因水平及蛋白水平均可明显下调Wnt2与β-catenin的表达，同时，P-gp的表达也明显降低，提示小剂量Cur可以通过下调Wnt2与β-catenin基因及蛋白的表达，降低Wnt/β-catenin信号通路活性，进而逆转Eca-109/VCR细胞的多药耐药性。
MMP-2是一种明胶酶，属于金属基质蛋白酶家族，主要降解明胶及Ⅳ型胶原。研究表明[13]，MMP-2与食管癌侵袭和转移有关。HMGB1是高迁移率族蛋白(high mobility group box chromosomal protein, HMG)家族的重要成员，参与调节DNA复制、转录、重组、修复等多种功能，可通过介导细胞因子及趋化因子的表达，促进恶性肿瘤的发生发展[14-15]。目前，MMP-2、HMGB1基因表达与食管癌MDR是否相关少见报道。本研究中，小剂量Cur联合VCR作用于Eca-109/VCR细胞24 h后，可明显下调MMP-2、HMGB1蛋白表达水平。提示小剂量Cur增强Eca-109/VCR细胞对化疗药的敏感性，逆转MDR的作用，还可能与下调MMP-2、HMGB1有关。
综上所述，Cur能够逆转Eca-109/VCR细胞的多药耐药性，其机制可能是通过下调Wnt2和β-catenin基因的表达，抑制Wnt2/β-catenin信号通路活性，以及降低MMP-2、HMGB1蛋白的表达实现的。Cur可能是一种能够提高癌细胞对化疗药的敏感性，并逆转其耐药性的较好的辅助化疗药物，有望解决化疗过程中肿瘤细胞耐药的难题。
( 致谢: 本实验在河北北方学院生命科学研究中心完成，感谢孙黎、兰金苹、张晓丽老师给予实验的指导和帮助！)
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