2. 新疆医科大学 护理学院，新疆 乌鲁木齐 830011;
3. 新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004
2. College of Nursing, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
3. Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medica, Urumqi 830004, China
肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是一种慢性的瘢痕形成与修复过程，是发病率和死亡率都很高的世界医学难题。HF的特点是细胞外基质过度沉积，晚期HF可诊断为肝硬化，并最终可能发展为肝衰竭，甚至肝细胞癌[1]。目前公认肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化是HF进展过程中的关键事件[2]。在HF进程中，HSC激活成肌成纤维细胞是瘢痕形成的关键环节[3-4]。中医具有治疗复杂疾病及相关疾病的功效，肉苁蓉(Cistanche)是著名的名贵补益类中药，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。课题组前期研究证实，肉苁蓉苯乙醇苷类化合物具有良好的保肝护肝作用，且其能引起Fas诱导的HSC凋亡[5]。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa，CPhGs)脂质体对HSC凋亡的影响及其分子机制，通过靶向载药系统转运药物，来克服一些药物半衰期短、无法到达靶器官，或到达了但无法在其周围形成有效药物浓度等缺点，最大程度发挥药物疗效，达到长效、靶向及减轻药物副作用等目的，期望能寻求更多的可以应用于临床治疗HF的靶向药物治疗途径，为HF的治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株大鼠HSC-T6细胞株，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号：ZQ0780。
1.1.2 药物与试剂用薄膜分散二次包封法制备pPB修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为212.7 nm，电位35~50 mV，包封率(38.46±7.85)%，由本实验室保存。胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)；MTT(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；TRIzol Reagent(Life technologies)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、RIPA裂解液(赛默飞公司)；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司)；蛋白定量试剂盒(Biomiga公司)；重组大鼠血小板衍生生长因子BB(recombinant rat platelet-derived growth factor BB，rrPDGF-BB) (R & D公司)；抗β-actin、JNK、p-JNK多克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)。
1.1.3 仪器超净工作台、全波长自动酶联免疫反应检验测试仪(美国Thermo Scientific公司)；CK-40型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；低温离心机(美国Sigma公司)；Western blot电泳装置及转膜装置(美国Bio-Rad公司)；QuantStudio 6 Flex型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与传代HSC-T6在含有100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至80%~90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，按1：2进行传代培养，所有实验采用对数生长期细胞。
1.2.2 细胞分组实验分为Normal组、rrPDGF-BB组、rrPDGF-BB+CPhGs脂质体(29.45、14.72、7.36 mg·L-1)组。各组细胞均培养24 h后，收集细胞进行后续实验。
1.2.3 MTT法检测细胞增殖HSC-T6以5 000个/孔密度接种至96孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设3个复孔。分别培养24、48、72 h，向每孔加入10 μL MTT溶液，培养箱内37℃培养4 h后，弃去MTT溶液，再向各孔加入100 μL DMSO，置于摇床室温摇动10 min，待结晶充分溶解后，于酶标仪492 nm波长处测定吸光度。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡取生长状态良好的对数生长期细胞，经胰酶消化后接种于6孔板，每孔细胞数为1×105个，24 h后按相应浓度加药，继续培养48 h后，每孔加入500 μL胰酶消化细胞，加完全培养液终止消化，吹打混匀移至15 mL离心管，PBS冲洗细胞，1 000 r·min-1离心5 min。弃上清，加PBS冲洗细胞2次，用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂标记后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA的表达TRIzol试剂盒提取HSC-T6总RNA，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书建立PCR反应体系，使用实时荧光定量PCR检测仪进行检测。PCR热循环参数为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环。结果分析以β-actin为内参基因，确定每个样本、每个基因扩增的循环阈值(CT)，按照2-△△CT计算目的基因的相对表达量，所用引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer sequence |
| α-SMA | F:5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3′ |
| R:5′-CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′ | |
| CollagenⅠ | F:5′-AACGCTATTGCCTGATGGACAGTC-3′ |
| R:5′-CGCTGAGTCAAGGATGACGAAGAG-3′ | |
| Collagen Ⅲ | F:5′-GACACGCTGGTGCTCAAGGAC-3′ |
| R:5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′ | |
| β-actin | F:5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′ |
| R:5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′ |
收集细胞，RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取相同质量的蛋白上样，经SDS-PAGE凝胶电泳转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，p-JNK、JNK一抗(1：5 000稀释)4℃摇床孵育过夜，TBST漂洗3次，二抗(1：5 000)室温孵育1 h，TBST漂洗3次后，化学发光显影试剂盒(ECL)曝光显影。利用图像分析软件Image J对条带进行灰度值的测定，计算分析各组蛋白相对表达量，以p-JNK与JNK条带信号强度的比值表示p-JNK蛋白表达水平。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用LSD法。
2 结果 2.1 CPhGs脂质体对rrPDGF-BB刺激的HSC-T6增殖的影响Fig 1的MTT结果显示，在24 h时，与Normal组比较，rrPDGF-BB组OD值明显增加(P < 0.05)；与rrPDGF-BB组比较，除CPhGs脂质体7.36 mg·L-1组外，其余CPhGs脂质体不同浓度组OD值均明显下降(P < 0.05)；与CPhGs脂质体7.36 mg·L-1组相比，CPhGs脂质体29.45 mg·L-1组OD值明显降低(P < 0.05)。在48、72 h时，与Normal组比较，rrPDGF-BB组和CPhGs脂质体不同浓度组OD值均明显增加(P < 0.05)；与rrPDGF-BB组比较，CPhGs脂质体不同浓度组OD值明显下降(P < 0.05)；与CPhGs脂质体7.36 mg·L-1组比较，CPhGs脂质体(14.72、29.45 mg·L-1)组OD值明显下降(P < 0.05)；与CPhGs脂质体14.72 mg·L-1组比较，CPhGs脂质体29.45 mg·L-1组OD值明显下降(P < 0.05)。结果提示，随着药物浓度增大和干预时间的延长，CPhGs脂质体各剂量组抑制HSC-T6增殖的作用呈现明显的剂量-效应关系。
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| Fig 1 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 proliferation (x±s, n=3) *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs rrPDGF-BB group; △P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1 group; ▲P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1 group |
如Fig 2所示，与Normal组相比，rrPDGF-BB组凋亡率下降(P < 0.05)；与rrPDGF-BB组相比，CPhGs脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升(P < 0.05)；与CPhGs脂质体7.36 mg·L-1组比较，CPhGs脂质体(14.72、29.45 mg·L-1)组凋亡率明显上升(P < 0.05)；与CPhGs脂质体14.72 mg·L-1组比较，CPhGs脂质体29.45 mg·L-1组凋亡率明显增高(P < 0.05)。结果显示，随着CPhGs脂质体药物浓度的升高，HSC-T6凋亡率也逐渐增高，CPhGs脂质体各剂量组间呈现剂量-效应关系。
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| Fig 2 Detection of apoptotic rate by flow cytometry (x±s, n=3) 1:Normal; 2:rrPDGF-BB; 3:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1; 4:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1; 5:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs rrPDGF-BB group; △P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1 group; ▲P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1 group |
如Fig 3所示，与Normal组比较，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在rrPDGF-BB组表达明显增加(P < 0.05)；与rrPDGF-BB组比较，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在CPhGs脂质体不同浓度组表达均下降(P < 0.05)；CPhGs脂质体各剂量组间比较，可见随CPhGs脂质体浓度增大，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA表达明显下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)，其中以CPhGs脂质体29.45 mg·L-1组抑制效果最明显。
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| Fig 3 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 mRNA expression of α-SMA, Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ(x±s, n=3) *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs rrPDGF-BB group; △P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1 group; ▲P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1 group |
如Fig 4所示，与Normal组比较，p-JNK蛋白在rrPDGF-BB和CPhGs脂质体不同浓度组表达明显增加(P < 0.05)；与rrPDGF-BB组比较，p-JNK蛋白在CPhGs脂质体不同浓度组表达下降(P < 0.05)；CPhGs脂质体各剂量组间比较，p-JNK蛋白随CPhGs脂质体干预剂量增加表达明显下降，呈现剂量-效应关系(P < 0.05)，其中以29.45 mg·L-1组效果最明显。
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| Fig 4 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 protein expression of p-JNK (x±s, n=3) 1:Normal; 2:rrPDGF-BB; 3:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1; 4:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1; 5:rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs rrPDGF-BB group; △P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1 group; ▲P < 0.05 vs rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1 group |
在慢性肝病中，HSC的反复激活导致HF，其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能[6]。目前，抗HF的主要策略是抑制HSC活化、增殖、收缩，诱导HSC凋亡。HSC的活化是HF的主要过程[7]，HF主要是由于细胞外基质过度沉积所致，而活化的肝HSC是细胞外基质的主要来源。肝损伤后，HSC经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程，α-SMA是HSC活化的标志物，α-SMA在肌成纤维细胞分化中起作用。α-SMA降低了收缩力和Collagen Ⅰ合成，并抑制伤口收缩。Collagen Ⅰ和α-SMA被认为是HF中诱导HSC活化的标志物，可以减少α-SMA的含量，促进HSC凋亡，逆转HF进程。宋阳等[8]的研究结果证实，其研究的药物可明显抑制HSC的增殖，促进其凋亡，并使α-SMA蛋白表达明显降低，以此降低细胞外基质的沉积，从而起到逆转HF的作用。由淑萍等[9]研究表明，肉苁蓉苯乙醇总苷可以抑制rrPDGF-BB诱导的HSC增殖。上述研究结果提示，抑制HSC的激活和增殖，促进HSC凋亡已成为阻止HF发生、发展的关键事件。最近的临床实验证据也提示，HF具有可逆性的[10]。HF的逆转与HSC的凋亡有着密切关联。HF逆转期，活化的HSC数量减少主要依靠细胞凋亡，而不是活化状态细胞向静止状态转化。细胞凋亡是细胞的主动“自杀”过程，与坏死不同，细胞凋亡发生于HF的产生和发展过程中。HSC凋亡在HF发展过程中不仅起着主动作用，而且贯穿整个纤维化形成的过程。本研究用不同浓度的CPhGs脂质体药物作用于HSC-T6 48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，与Normal组相比，rrPDGF-BB组凋亡率下降，CPhGs脂质体(29.45、14.72 mg·L-1)组凋亡率上升，与rrPDGF-BB组相比，CPhGs脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升，且CPhGs脂质体不同浓度组相比，差异具有统计学意义。实验结果表明，CPhGs脂质体可诱导HSC-T6的凋亡，且凋亡程度与CPhGs脂质体浓度存在联系，CPhGs脂质体各剂量组间表现出明显的剂量-效应关系。
HF是指结缔组织过度增殖和异常沉积，特别是胶原蛋白、非胶原蛋白和肝小叶门管区的蛋白多糖等。因此，细胞外基质降解和生成之间的不平衡是HF发生与发展的关键因素。因此，保护肝细胞，促进肝再生，保持胶原蛋白的正常代谢也成为预防和治疗HF的重要措施。人类有19种胶原蛋白，在肝脏中存在的有5种类型，在HF的总蛋白中胶原蛋白约占50%，主要涉及Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ。在肝脏中，Collagen Ⅰ占60%~70%，Collagen Ⅲ占20%~30%，是构成细胞外基质的主要成分。因此，Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ被认为是反映胶原蛋白在肝脏中进行新陈代谢的重要参数。李伟伟等[11]的研究结果显示所研究药物可通过抑制CollagenⅢ沉积而起到抗HF作用。张扬武等[12]的实验结果也证实了可通过抑制HSC的活化，降低Collagen Ⅰ的表达, 达到逆转HF的作用。本研究采用实时荧光定量PCR检测α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ基因表达，研究结果显示，与Normal组相比，rrPDGF-BB组α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表达明显增高，与rrPDGF-BB组相比，不同浓度的CPhGs脂质体组均可不同程度下调α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的mRNA表达，其中29.45 mg·L-1 CPhGs脂质体组下调作用最明显，且随着药物浓度的升高，其下调程度越明显。我们认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对rrPDGF-BB引起的HSC增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。因此，我们认为其能抑制HSC增殖，促进其凋亡，以此来阻止HF的形成。
JNK已显示对不同细胞类型的细胞增殖有积极的调节作用，JNK通过负性调节作用来抑制静止HSC的活化，从而阻止HSC的增殖，刺激MAPK信号通路，从而使其下游通路阻断，起到预防HF的作用。本研究结果显示，与Normal组比较，rrPDGF-BB组p-JNK的蛋白表达量明显增高，表明rrPDGF-BB可通过影响MAPK信号，使HSC活化增殖。不同浓度的CPhGs脂质体组，p-JNK的蛋白表达量随着药物浓度的升高逐渐降低，且不同浓度的CPhGs脂质体组p-JNK的蛋白表达量与rrPDGF-BB组比较，差异均有统计学意义。由此可见，CPhGs脂质体可在一定程度上抑制rrPDGF-BB诱导的HSC增殖与活化，促进HSC凋亡，从而抑制HF的发生、发展。本研究结果为后续实验进一步研究CPhGs脂质体抗HF作用机制提供了扎实的理论基础。期望能够寻求更多抗HF的靶向给药途径，给HF患者带来福音。
( 致谢: 本实验主要在新疆医科大学2011协同中心完成，在此特别感谢姜平、盛磊老师提供的支持与帮助，对王志强师兄和张石蕾师姐提供的帮助及指导表示衷心感谢！)
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