2. 广州医科大学 基础医学实验教学中心机能实验室，广东 广州 511436
2. Medical Functional Lab, Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, China
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由于免疫功能紊乱、微生物感染、遗传因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛素功能减退或胰岛素抵抗而引起的糖、蛋白质、脂肪等一系列的代谢紊乱综合征，临床上主要以慢性血糖升高为主要特点。DM分为两种类型，1型DM也叫胰岛素依赖型，是由于胰岛B细胞被破坏，导致胰岛素绝对缺乏。2型DM也叫非胰岛素依赖型，由于胰岛素功能受损，导致胰岛素相对缺乏。DM已经成为全世界发病率、死亡率最高的5种疾病之一。中国是DM大国，据统计，我国18岁及以上的成年人中DM患者已经超过1亿，DM血管病变是DM患者主要的慢性并发症，也是导致DM患者死亡的主要原因[1]。常见的血管病变分为大血管病变和微血管病变。大血管病变有心血管病变和脑血管病变，容易导致冠心病和脑卒中。微血管病变主要发生在肾脏、视网膜及皮肤的微血管，容易造成糖尿病性肾病，糖尿病性视网膜病变以及皮肤缺血性溃疡。DM血管病变主要归因于内皮细胞以及平滑肌细胞结构和功能障碍。因此，深入研究并阐明内皮细胞和平滑肌细胞功能受损参与DM血管并发症的分子机制，并在此基础上寻找干预靶点，对防治DM及其血管并发症具有重要意义。
香芹酚(carvacrol，CAR)普遍存在于许多芳香植物的挥发油中，如牛至、百香果、冬季香薄荷、亚加菌等。CAR具有分子小、脂溶性高、易通过细胞膜等特点，同时对人体无毒，因而在日常生活中得到了广泛应用，经常作为香料添加剂在食品中使用。目前的研究证实，CAR具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗菌[5]等生物活性。进一步的研究报道，CAR能促进大鼠离体胸主动脉内皮依赖性的血管舒张[6]。Suntres等[7]报道，在脑动脉分离的内皮细胞中，CAR通过激活TRPV3通道，使内皮细胞和平滑肌细胞发生超极化，导致血管舒张。以上研究提示CAR具有血管保护作用，但CAR对1型DM小鼠主动脉血管重构的影响目前尚不清楚。因此，本研究以C57BL/6小鼠为主要研究对象，通过腹腔注射链脲霉素(streptozocin，STZ)建立1型DM模型，探讨CAR对DM小鼠主动脉血管重构的影响。
1 材料 1.1 药物与试剂CAR购自美国Aldrich公司；STZ购自美国Sigma公司；p-Akt、Akt、p-PDK1、PDK1、α-actin、Ki67抗体，均购自美国Cell Signal Technology公司。
1.2 实验动物SPF级C57BL/6小鼠，7~8周龄，♂，体质量(22.0±3.0)g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证：SCK(粤)2013-0002。饲养环境模拟自然昼夜条件，湿度45%~50%，温度(22±3)℃，自由饮水。
1.3 仪器低温高速离心机(美国Eppendorf公司)；稳豪型血糖仪及血糖试纸(美国强生公司)；多功能酶标仪(美国Beckman公司)；自动洗片机(美国Kodak公司)。
2 方法 2.1 DM模型的制备与分组DM模型组小鼠腹腔注射0.2% STZ(45 mg·kg-1·d-1)，连续注射5 d。对照组给予相应剂量的柠檬酸缓冲液。注射结束后3 d，检测小鼠血糖，将血糖浓度高于16.7 mmol·L-1的小鼠视为DM模型诱导成功。DM模型诱导成功后第4周，检测小鼠血糖持续、稳定升高，进行以下实验分组：①对照组(Con)；② DM组；③ CAR低剂量组(DM+CAR 10 mg·kg-1)；④ CAR高剂量组(DM+CAR 20 mg·kg-1)。每天腹腔注射CAR 1次，连续给药6周。每周测量小鼠体质量和随机血糖。给药6周后处死小鼠，取出胸主动脉。
2.2 HE染色主动脉固定在4%的多聚甲醛中，48 h内进行石蜡包埋，用苏木精和伊红染色，然后在光学显微镜下分析。
2.3 Western blot检测主动脉裂解后，离心后取上清，BCA法蛋白定量，并制成蛋白样品。经SDS-PAGE分离蛋白，电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温振荡封闭1 h。用BSA/TBS稀释的一抗4℃孵育过夜。TBST洗涤5 min，反复3次，二抗室温孵育1 h，TBST漂洗10 min，反复3次。加入ECL显色液，暗室内X线片曝光。Image J软件分析条带。
2.4 免疫组化检测石蜡切片脱蜡至水，然后进行抗原修复，接着用3% BSA封闭30 min，在切片上滴加一抗4℃孵育过夜，d 2滴加二抗，然后用DAB显色，复染细胞核，脱水封片，显微镜拍照采集图像。
2.5 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各组数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
3 结果 3.1 CAR对1型DM小鼠随机血糖的影响如Fig 1所示，与正常小鼠相比，DM小鼠的随机血糖明显升高；与DM小鼠相比，CAR给药组小鼠的随机血糖降低(P < 0.05)，且CAR低剂量组小鼠的随机血糖与高剂量组相比，差异无统计学意义。说明CAR可以明显降低1型DM小鼠的血糖。
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| Fig 1 Changes of mice random blood glucose during experiments (x±s, n=5) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs DM |
Fig 2的HE结果显示，DM组与正常组相比，主动脉血管壁变薄，细胞数量减少。低、高剂量CAR组可明显改善DM小鼠主动脉血管重构，增加血管壁厚度。说明CAR可以明显改善DM小鼠主动脉血管重构。
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| Fig 2 Morphological characteristics of aorta by HE staining |
为了研究CAR改善血管重构的机制，分别用Western blot和免疫组化检测了主动脉α-actin和Ki67的表达。Fig 3A的Western blot结果显示，与对照组相比，DM组α-actin表达明显增加(P < 0.05)，低、高剂量CAR组可抑制DM诱导的α-actin表达增加(P < 0.05)。Fig 3B的免疫组化结果显示，DM组相比对照组Ki67表达降低(P < 0.05)，而低、高剂量CAR组可明显逆转DM诱导的Ki67表达降低(P < 0.05)。
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| Fig 3 Effects of CAR on expression of α-actin and Ki67 in aorta by Western blot A: Western blot results showed the expression of α-actin in the aorta (x±s, n=5). *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs DM. B: Immunohistochemistry results showed the expression of Ki67 in aorta. |
为了研究CAR是否通过PI3K/Akt通路，改善主动脉血管重构，我们检测了PDK1和Akt的表达水平。Fig 4的Western blot结果显示，与对照组相比，DM组主动脉PDK1和Akt的磷酸化水平明显降低(P < 0.05)，低、高剂量CAR组可明显抑制DM诱导的PDK1和Akt磷酸化水平的降低(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effects of CAR on phosphorylation of PDK1 and Akt in aorta by Western blot (x±s, n=5) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs DM |
DM是严重威胁人类健康的重大疾病之一，心血管疾病是DM的重要并发症，每年DM患者死于心血管疾病的比例占总死亡人数的50%~80%[8]。因此，DM诱发的心血管疾病是导致DM患者死亡的主要原因，研究DM心血管病变的分子机制具有十分重要的意义。
CAR又名香荆芥酚，具有麝香草酚类的气味，存在于各类天然植物、果实及植物挥发油中，是牛至属植物油的主要成分。在日常生活中，CAR常用于配制消毒剂、杀菌剂、香料、食品添加剂及防腐剂等。近年来，CAR在DM及其并发症中的作用得到了研究者们的日益关注。有研究发现，在DM早期口服CAR可以轻度降低DM大鼠血糖，明显降低总胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶[9]。Deng等[10]发现，CAR通过抗氧化、抑制炎症等效应，改善DM大鼠认知功能障碍，对神经系统具有保护作用。项目组前期研究通过腹腔注射STZ建立1型DM小鼠模型，连续6周给予小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)腹腔注射，发现CAR长期使用具有良好的降血糖效果。此外，CAR还可以轻度降低DM小鼠甘油三酯水平，改善DM小鼠脂质代谢紊乱[11]。但CAR对DM诱发的心血管并发症是否具有保护作用，及其机制目前尚不清楚，亟待深入研究。因此，在前期研究基础上，本课题通过腹腔注射低、高剂量CAR，检测DM小鼠的主动脉血管形态及功能，评价CAR对1型DM小鼠血管重构的影响，并初步探讨其机制。
本研究结果发现，长期连续给予1型DM小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)，其随机血糖明显降低，高剂量与低剂量组相比，差异无统计学意义。HE结果显示，DM组主动脉血管壁变薄，细胞丢失。给予低、高剂量的CAR后，DM小鼠主动脉血管壁厚度都基本恢复至正常水平。DM血管病变可主要归因于内皮细胞和平滑肌细胞结构和功能失调。其中，血管平滑肌细胞主要分布于动脉中膜，生理状态下表现为收缩型，用于维持动脉收缩和舒张功能。在一些病理因素刺激下，细胞因子以自分泌或旁分泌的方式，促进血管平滑肌表型由收缩型转变为合成型，从而促进血管平滑肌的增殖。研究表明，高糖通过激活Rho/蛋白激酶C通路，促进肌动蛋白聚合，诱导血管平滑肌细胞收缩功能增加[12]。Schmidt等[13]也证明，在1型DM模型中，Toll样受体2通过激活RhoA通路，促进血管平滑肌收缩型标志基因肌球蛋白轻链、肌球蛋白磷酸酶亚单位Ⅰ的表达，从而增强血管的收缩功能。因此，在本实验中，我们检测了收缩型标志基因α-actin和合成型标志基因Ki67的表达。结果显示，DM组α-actin表达增加，Ki67表达降低，低、高剂量CAR明显降低DM组α-actin的表达，增加Ki67的表达。说明CAR能通过改变平滑肌细胞表型，改善1型DM持续高糖诱导的血管重构。
PI3K/Akt通路在细胞代谢、细胞周期调控、细胞凋亡、胰岛素抵抗等生物学过程中发挥重要作用[14]。PDK1、Akt作为该通路的两个关键激酶，其磷酸化状态代表该通路的活化状态。Hamamdzic等[15]的研究表明，在DM联合高脂饮食诱导的猪模型中，Akt及其下游糖原合成酶激酶-3β的磷酸化被明显抑制，导致细胞增殖与凋亡失衡，从而加剧动脉粥样硬化。我们的研究结果与前期文献报道一致，本实验结果显示，DM组PDK1及Akt的磷酸化水平受到抑制，给予低、高剂量的CAR后，Akt的磷酸化水平有所恢复，且PDK1的磷酸化水平基本恢复正常。说明CAR可能通过调节PI3K/Akt通路，抑制血管平滑肌的收缩功能，改善DM血管重构。
综上所述，本实验发现CAR可降低1型DM小鼠血糖，改善主动脉血管重构，对DM及并发的血管疾病有一定的治疗作用。今后的工作中，我们将进一步在细胞水平明确CAR对血管重构的影响及其分子机制，为确定DM并发的血管疾病治疗的新靶点提供初步的实验依据。
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