2. 安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001
2. Medical College, Anhui University of Science and Technology, Huainan Anhui 232001, China
椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease, DDD)已成为严重影响人们生活质量的高发病[1]。目前除生物力学改变为其病因外，IL-1β、TNF-α等炎症因子在发病过程中的重要性逐渐被认识。研究证实，IL-1β在软骨细胞退变及凋亡过程中处于关键地位，是椎间盘退行性病变的病因之一[2-4]。前期研究发现，活血化瘀代表药红花提取物羟基红花黄素A(hydroxy safflower yellow A，HSYA)具有调控IL-1β信号通路，延缓软骨终板细胞凋亡的作用[5]，但具体机制尚不明确。本实验研究发现，HSYA能够改变退变软骨终板细胞周期，可能是HSYA抑制退变软骨终板细胞凋亡的机制之一。
1 材料 1.1 实验动物健康昆明种小鼠，♀♂各半，SPF级，4周龄，购自上海莱克实验动物有限责任公司，许可证编号：SCXK(沪)2007-0005。
1.2 试剂完全培养基DMEM、胎牛血清，购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Promega公司；细胞因子IL-1β购自Prospec公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p53、p21抗体，均购自Santa cruz公司；β-actin抗体购自CST公司；Dylight二抗购自上海西美杰公司；Ⅱ型胶原酶购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购自DOJINDO公司；RNA逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒，购自大连宝生公司；引物为Invitrogen公司上海合成部生产；碘化丙啶为北京宝赛公司产品。
1.3 仪器BNA-311型培养箱(Espec公司)；酶标仪(美国Themo公司)；Odyssey近红外扫描仪(美国LICOR公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；CFX96 PCR仪(美国Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 椎间盘软骨终板细胞的分离培养及诱导、分组将小鼠断颈处死。无菌的条件下剪开背部皮肤，体视学显微镜下用手术刀削取L1-L5椎间盘软骨，放入PBS培养皿中，清除血污及其它组织。用含100 kU·L-1青-链霉素的PBS缓冲液冲洗后，移入超净台，将软骨组织尽量剪碎。加入2 g·L-1的Ⅱ型胶原酶3 mL，将培养皿放置恒温摇箱中，37℃消化3~4 h。大部分细胞游离时，采用移液器将细胞吹打成单细胞悬液，加入3 mL体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中和后，用15 mL离心管收集细胞，在低温离心机中1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入10%胎牛血清的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞悬液均匀分布。待细胞长至90%时，传代分组。正常组换成含1%胎牛血清的DMEM，诱导组换成诱导培养基(IL-1β浓度为10 μg·L-1的含1%胎牛血清DMEM)后培养，给药组用不同浓度HSYA加诱导培养基。如：细胞增殖检测、流式细胞仪分析、real-time PCR检测的实验分为6组：正常组、诱导组、4组给药组。其中，给药组HSYA浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7 mol·L-1；Western blot给药组HSYA浓度为10-5 mol·L-1。
2.2 CCK-8法检测不同时间点各组细胞增殖情况将第3代软骨细胞按4×104个接种于2块96孔酶标板中，每孔100 μL，除6组实验组外，设立空白对照组，不接种细胞，每组3个复孔。分别培养1、3、5、7、9 d。换新鲜DMEM 100 μL，每孔内加新鲜配制的CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，振荡2 min。在全自动酶标仪上检测光密度OD值，检测波长为450 nm。
2.3 流式细胞仪分析细胞周期消化细胞大约5×105个，PBS漂洗后，用体积分数为70%的乙醇制成单细胞悬液，固定过夜，次日1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS漂洗后，加入终浓度为20 mg·L-1 RNAnase，37℃消化1 h，离心弃上清，加入碘化丙啶5 min后，上机检测。
2.4 Real-time RT-PCR检测细胞周期及凋亡相关基因p53、Bax、Bcl-2 mRNA的表达提取细胞总RNA，经紫外分光光度仪检测RNA含量和纯度。按照逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录成cDNA，反应条件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time PCR反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，去离子水7 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。反应过程如下：95℃预变性10 min，进入循环，95℃变性20 s，退火5 s(p53、Bax、Bcl-xl、β-actin的退火温度分别为58℃、60℃、56℃、58℃)，72℃延伸20 s，循环扩增，循环次数均为40次，最终72℃延伸10 min。反应结束后，以每一样体所含p53、Bax、Bcl-xl mRNA的拷贝数和其β-actin内参基因的拷贝数的比值进行比较。采用-△ CT法比较各组基因表达情况。引物序列如下：p53上游引物5′-GCTCACCCTGGCTAAAGTTCTG-3′，下游引物5′-AGTCGCTACCTACAGCCAGGAT-3′；Bax上游引物5′-GGTT GCCCTCTTCTACTTTGC-3′，下游引物5′-TCTTCCAG ATGGTGAGCGAG-3′；Bcl-xl上游引物5′-CCCCCCA CATCTCAGTTCTCT-3′，下游引物5′-GCCTCCAAGG AGCTGGTTTAG-3′；β-actin上游引物5′-GGAGATT ACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCA TCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。
2.5 Western blot检测蛋白表达以每孔每毫升1×105个细胞，放置于6 cm培养皿中。用RIPA试剂裂解细胞。测定蛋白浓度，确保每个蛋白样品的上样量一致。沸水中蛋白变性5 min，4℃冷却，待用。12%的SDS-PAGE分离胶，取20 μL样品(约30 μg蛋白)上样，以100 V恒压电泳。300 mA，90 min转移至PVDF膜，用含5% BSA的TBST室温封闭1 h。一抗(1 :1 000)4℃孵育过夜。TBST洗膜2次，每次10 min，用Dylight标记相应二抗室温孵育30 min。TBS(0.1 mol·L-1 NaCl，0.1 mol·L-1 Tris-HCl，pH7.5)洗膜3次，每次10 min，在红外激光成像系统Odeyssey上成像。数据用样品与β-actin的比值表示。
2.6 统计学分析数据采用x±s表示。采用单因素方差分析的Dunnet-t检验，使用SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析。
3 结果 3.1 HSYA对退变软骨细胞增殖的影响各组大约在5 d开始进入对数生长期，7 d后进入平台期，9 d后逐渐进入衰退期，其中，诱导组相对于正常对照组，进入对数生长期起峰较低，且进入平台期OD值也低于正常对照组，各HSYA给药组对数生长期及平台期OD值均高于诱导组。与正常对照组比较，诱导组IL-1β在不同时间段对软骨终板细胞增殖均具有抑制作用。不同浓度的HSYA均可拮抗IL-1β对软骨细胞增殖的抑制作用，与诱导组比较差异有统计学意义(P < 0.05)，HSYA各浓度组之间比较差异无显著性，见Tab 1。
| Group | Multiplication(OD) | |||||
| 1 d | 3 d | 5 d | 7 d | 9 d | 11 d | |
| Normal | 0.10±0.01 | 0.18±0.02 | 0.26±0.05 | 0.61±0.06 | 0.67±0.08 | 0.54±0.07 |
| Induced | 0.09±0.01# | 0.12±0.04# | 0.13±0.02# | 0.49±0.06# | 0.44±0.09# | 0.42±0.05# |
| HSYA 10-4 mol·L-1 | 0.10±0.04* | 0.19±0.07* | 0.20±0.09* | 0.60±0.11* | 0.77±0.14* | 0.61±0.10* |
| HSYA 10-5 mol·L-1 | 0.08±0.02* | 0.21±0.03* | 0.33±0.13* | 0.63±0.13* | 0.73±0.11* | 0.62±0.12* |
| HSYA 10-6 mol·L-1 | 0.14±0.03* | 0.18±0.05* | 0.30±0.02* | 0.71±0.13* | 0.70±0.18* | 0.57±0.11* |
| HSYA 10-7 mol·L-1 | 0.12±0.02* | 0.23±0.07* | 0.30±0.05* | 0.80±0.06* | 0.76±0.07* | 0.53±0.11* |
| #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs induced | ||||||
如Fig 1所示，诱导组S期比例较正常组S期比例高，各给药组S期细胞比例较诱导组低，其中以HSYA(10-5、10-6 mol·L-1)组最为接近正常组。
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| Fig 1 Results of testing cell cycle after 24 h administration |
加药24、48 h后，分别检测各组mRNA。如Fig 2所示，诱导组p53 mRNA表达较正常组高，各给药组p53 mRNA表达量低于诱导组，差异有统计学意义(P < 0.05)，其中，以HSYA 10-5mol·L-1组p53表达最低；诱导组Bcl-xl mRNA表达低于正常组及HSYA给药组；诱导组Bax mRNA表达高于正常组及HSYA给药组。
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| Fig 2 The mRNA expression levels of Bcl-xl (A), Bax(B) and p53(C)(x±s, n=3) A. The mRNA expression levels of Bcl-xl in each group, after administrated for 24 and 48 hours; B. The mRNA expression levels of Bax in each group, after administrated for 24 and 48 hours; C. The mRNA expression levels of p53 in each group, after administrated for 24 and 48 hours; #P < 0.05 vs normal group; *P < 0.05 vs induced group |
如Fig 3所示，加药培养24 h后，HSYA 10-5 mol·L-1组PCNA蛋白表达量较诱导组高，较正常组低；诱导组p53、p21表达高于正常组及HSYA 10-5 mol·L-1组。
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| Fig 3 The protein expression levels of PCNA, p53 and p21 in each group(x±s, n=3) #P < 0.05 vs normal group; *P < 0.05 vs induced group |
软骨终板细胞凋亡是导致椎间盘退变的重要原因之一[6-7]。炎症因子IL-1β的表达和释放，可导致软骨终板细胞的凋亡及退变[8]。因此，减少IL-1β分泌，拮抗其作用，可以延缓椎间盘退变进程。正常软骨细胞中，p53与Puma结合，无生物学活性。炎症因子作用下，p53被激活，核内p53水平增加，转录激活Puma，Puma与p53解离后与Bcl-xL的结合，释放p53，p53直接激活Bax，改变线粒体通透性，促进细胞凋亡[9]。HSYA能够通过下调p53蛋白表达，发挥抑制退变细胞凋亡的作用。
炎症刺激下，DNA损伤后，可引起p53依赖的细胞周期阻滞，p53表达升高，激活下游分子p21[10]。后者通过C端结构域与不溶性PCNA结合，抑制其活性，阻止损伤DNA长链复制。不溶性PCNA在G0-G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2-M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[11]。实验结果显示，软骨终板细胞退变后PCNA表达下降，HSYA可一定程度上调PCNA表达，这与细胞增殖检测结果相同，提示HSYA能够部分拮抗IL-1β抑制细胞增殖的作用，上调PCNA表达。流式结果显示，退变后细胞S期增高，则可能是由于IL-1β导致DNA损伤后，细胞首先启动损伤感应机制，细胞生长发生停滞，继而启动DNA修复，修复成功细胞可进入下一周期，修复失败细胞将启动凋亡机制[12-13]。正常组及各药物组细胞已进入下一周期，而退变细胞组细胞生长停滞，进行DNA修复，S期比例较高，细胞凋亡增加[11]。
前期实验主要证实了IL-1β可诱导软骨终板细胞发生退变及凋亡，HSYA具有拮抗IL-1β作用[5]，但其具体机制尚不明确。本研究通过对凋亡及细胞周期上游蛋白的检测，进一步发现HSYA能够改变退变软骨细胞周期，这可能是其拮抗IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的作用途径之一。
综上所述，本研究证实了HSYA具有上调PCNA，下调p53、p21的作用。HSYA可通过调节细胞周期相关蛋白，发挥其促进细胞增殖，抑制IL-1β诱导的软骨终板细胞凋亡的作用，提示HSYA具有改善椎间盘退变的潜能。
( 致谢: 本研究主要在上海市同济医院检验科实验室及中心实验室完成，感谢课题组成员在本研究过程中提供帮助与指导。)
| [1] | Jung H J, Park J B, Kong C G, et al. Postoperative urinary retention following anterior cervical spine surgery for degenerative cervical disc diseases[J]. Clin Orthop Surg, 2013, 5(2): 134-7. doi:10.4055/cios.2013.5.2.134 |
| [2] | Nisticò S, Paolillo N, Minella D, et al. Effects of TNF-α and IL-1β on the activation of genes related to inflammatory, immune responses and cell death in immortalized human HaCat keratinocytes[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2010, 23(4): 1057-72. doi:10.1177/039463201002300410 |
| [3] | 吴小山, 陈飞虎, 葛金芳, 等. 胞外酸化对大鼠关节软骨细胞焦亡的影响及可能机制[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(11): 1531-9. Wu X S, Chen F H, Ge J F, et al. Effects of extracellular acidosis on pyroptosis of rat articular chondrocytes and its possible mechanisms[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(11): 1531-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.011 |
| [4] | 杨青山, 吴树金, 施松波, 等. 姜黄素通过上调PPARγ抑制糖基化终末产物诱导的软骨细胞凋亡及线粒体功能损伤[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(2): 261-7. Yang Q S, Wu S J, Shi S B, et al. Curcumin inhibits advanced glycation end products-induced cell apoptosis and mitochondrial dysfunction via elevating PPARγ in chondrocyte[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(2): 261-7. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2018.02.022 |
| [5] | 张宇, 赵永见, 周泉, 等. 羟基红花黄素A拮抗IL-1β诱导小鼠软骨终板细胞凋亡的作用机制[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(12): 1704-10. Zhang Y, Zhao Y J, Zhou Q, et al. The anti-apoptotic effect of hydroxy safflower yellow A on endplate chondrocytes induced by IL-1β[J]. Chin Pharmacol Bull, 2011, 27(12): 1704-10. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2011.12.018 |
| [6] | 牛凯, 赵永见, 姚长风, 等. 苦杏仁苷对IL-1β诱导后大鼠椎间盘软骨终板细胞的影响[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(12): 1725-30. Niu K, Zhao Y J, Yao C F, et al. Effects of amygdalin on the endplate chondrocytes induced by IL-1β derived from rats' intervertebral discs[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29(12): 1725-30. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2013.12.023 |
| [7] | Hwang H S, Kim H A. Chondrocyte apoptosis in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 26035-54. doi:10.3390/ijms161125943 |
| [8] | Zhang C C, Zhou J S, Hu J G, et al. Effects of IGF-1 on IL-1β-induced apoptosis in rabbit nucleus pulposus cells in vitro[J]. Mol Med Rep, 2013, 7(2): 441-4. doi:10.3892/mmr.2012.1238 |
| [9] | Nakano K, Vousden K H. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53[J]. Mol Cell, 2001, 7(3): 683-94. doi:10.1016/S1097-2765(01)00214-3 |
| [10] | Cavallo F, Feldman D R, Barchi M. Revisiting DNA damage repair, p53-mediated apoptosis and cisplatin sensitivity in germ cell tumors[J]. Int J Dev Biol, 2013, 57(2-4): 273-80. |
| [11] | Zerjatke T, Gak I A, Kirova D, et al. Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification[J]. Cell Rep, 2017, 19(9): 1953-66. doi:10.1016/j.celrep.2017.05.022 |
| [12] | Mailand N, Gibbs-Seymour I, Bekker-Jensen S. Regulation of PCNA-protein interactions for genome stability[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2013, 14(5): 269-82. doi:10.1038/nrm3562 |
| [13] | Kale J, Osterlund E J, Andrews D W. BCL-2 family proteins: changing partners in the dance towards death[J]. Cell Death Differ, 2018, 25(1): 65-80. doi:10.1038/cdd.2017.186 |