2. 泰州市人民医院 风湿免疫科,江苏 泰州 225300;
3. 江苏省武警总队医院内科,江苏 扬州 225001;
4. 扬州大学附属医院血液风湿科,江苏 扬州 225001;
5. 扬州大学医学院,江苏 扬州 225001
2. Dept of Rheumatology and Immunology, Taizhou People's Hospital, Taizhou, Jiangsu 225300, China;
3. Dept of Internal Medicine, Jiangsu Provincial General Hospital of Armed Police Force, Yangzhou, Jiangsu 225001, China;
4. Dept of Hematology and Rheumatology, Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225001, China;
5. Medical College of Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu 225001, China
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)作为多关节炎症性疾病,其主要的病理改变包括关节滑膜炎及血管炎。关节滑膜细胞分为A型巨噬样滑膜细胞和B型成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)。FLS位于滑膜衬里层,可向关节软骨表面迁移和侵袭,导致关节软骨及骨的侵蚀,最终引起关节破坏,在RA的发生、发展过程中发挥重要作用[1]。血小板微颗粒(platelet-derived microparticles,PMPs)是血小板活化过程中形成的囊性小泡[2]。我们的前期研究证实,PMPs能够通过ERK/NF-κB通路及CXCR2/NF-κB通路,促进RA-FLS与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的黏附,提高其迁移和侵袭能力[3-4],提示PMPs通过NF-κB信号通路,影响RA-FLS的迁移及侵袭,可能为RA骨侵蚀机制的研究提供了新视角。
金雀异黄素(genistein,Gen)是一种异黄酮类化合物,广泛存在于豆类植物中,具有酪氨酸激酶抑制剂活性[5]。课题组前期研究证实,Gen可抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)等炎症因子的分泌,以及胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠FLS的增殖,同时缓解CIA大鼠关节炎症和关节的损害[6-8]。本实验进一步观察Gen对PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的机制,为RA治疗的靶点选择提供理论依据,并为临床医师的工作提供参考。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器DMEM高糖培养基(HyClone公司);胎牛血清(FBS,Gibco公司);Gen、罗丹明标记的鬼笔环肽(Sigma公司);人纤维连接蛋白(fibronectin,瑞士罗氏公司);Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Matrigel(美国BD公司);CCK-8(上海生博生物医药科技有限公司);兔抗人NF-κB、p-NF-κB、p-IκB及鼠抗人IκB单克隆抗体(CST公司);小鼠抗GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz公司)。PMPs的制备和鉴定,按本课题组前期建立的方法进行[4]。二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);垂直电泳槽、电转移槽(Bio-Rad公司);荧光显微镜(日本NIKON公司)。
1.2 细胞培养RA-FLS细胞株MH7A购自上海赛齐生物科技有限公司。使用含10% FBS的DMEM高糖培养基培养,置于37 ℃、5% CO2以及饱和湿度条件中,择生长良好的3~6代细胞用于后续实验。
1.3 细胞活力检测实验空白组不做任何处理;PMPs组给予100 mg·L-1 PMPs处理24 h;另外3组为PMPs+Gen组,在100 mg·L-1 PMPs作用24 h后,给予20、40、60 μmol·L-1的Gen干预24 h。将各组细胞接种于96孔板,细胞数量约为每孔5×103个,设置6个复孔,37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,按CCK-8试剂盒说明操作,于酶标仪上测量波长450 nm处的OD值,实验重复3次。设定空白组细胞活力为100%,其他各组相对细胞活力=实验组细胞OD值/空白组细胞OD值×100%。
1.4 Transwell细胞迁移与侵袭实验 1.4.1 迁移实验空白组细胞密度达90%时,使用无血清培养基饥饿12 h;PMPs组和PMPs+Gen组细胞先后使用含100 mg·L-1 PMPs的完全培养基(10% FBS)和含100 mg·L-1 PMPs的无血清培养基培养12 h。0.25%胰蛋白酶消化MH7A,室温下1 200 r·min-1离心10 min收集;用低浓度血清培养基(2% FBS)重悬细胞,细胞计数后,制成5×108·L-1的细胞悬液,PMPs+Gen组细胞悬液加入不同浓度的Gen;将上述细胞悬液分别加至Transwell上室,每孔100 μL;在Transwell下室分别加入完全培养基500 μL,其中PMPs+Gen组Transwell下室加入不同浓度的Gen;放入小室培养24 h;取出小室,吸去上室液体,PBS清洗3次,用棉签拭去上室细胞,将小室倒扣晾干;向下室加入快速吉姆萨染色试剂A液,固定2 min,取出小室,加入2倍体积的B液,混匀后染色8 min;PBS洗涤后,于100×倒置显微镜下,随机选取8个视野拍摄,计算每个视野内的细胞数,结果用相对于空白组倍数的均值表示,实验重复3次。
1.4.2 侵袭实验按前述方法处理MH7A;取100 mg·L-1的Matrigel稀释液100 μL包被小室,37 ℃孵育过夜;吸净残液后,向小室中加入100 μL DMEM培养基,37℃孵育30 min,水化基底膜;其余步骤同迁移实验。
1.5 细胞与ECM黏附实验 1.5.1 细胞与Collagen Ⅰ、Fibronectin黏附实验按细胞活力检测实验方法处理细胞;分别取浓度为10 mg·L-1的Collagen Ⅰ、Fibronectin工作液100 μL置于96孔板中,4 ℃过夜;弃上清,加入1% BSA 100 μL,37 ℃封闭1 h;收集细胞,制备2.5×108·L-1的细胞悬液,每孔加入100 μL,设6个复孔,孵育30 min;去上清及PBS洗涤后,每孔加入100 μL无血清培养基和10 μL CCK-8试剂,孵育30 min;用酶标仪测定波长450 nm处的OD值,实验重复3次。
1.5.2 细胞与Matrigel黏附实验类似于“1.5.1”实验,区别为铺胶时,每孔加浓度为100 mg·L-1的Matrigel稀释液50 μL,37 ℃孵育1 h。
1.6 细胞免疫荧光染色收集细胞,接种于放有盖玻片的24孔板中,细胞数量约为每孔5×104个,按细胞活力检测实验方法处理细胞;用免疫荧光固定液室温固定30 min;再加入含0.5% Triton X-100的PBS,室温透化细胞10 min;3% BSA室温封闭1 h后,用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞,室温避光孵育2 h;再以0.5 mg·L-1 DAPI室温避光孵育样本15 min;洗涤封片后,在荧光显微镜下观察拍照。
1.7 Western blot检测按细胞活力检测实验处理MH7A后,收集各组细胞进行蛋白提取和浓度测定。按照Western blot常规步骤操作,用Image J软件分析蛋白质免疫印迹图像灰度值。
1.8 数据分析使用SPSS 19.0版或Excel 2014版,数据用x±s表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK检验。
2 结果 2.1 Gen对PMPs作用后RA-FLS的活力无明显影响Fig 1的CCK-8检测结果显示,与空白组比较,PMPs作用后RA-FLS的活力稍有增强;然而,空白组、PMPs组和PMPs+Gen(20、40、60 μmol·L-1)组之间细胞活力比较差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.2 Gen抑制PMPs诱导的RA-FLS的迁移和侵袭Fig 2、3的Transwell迁移和侵袭实验结果显示:与空白组相比,PMPs组RA-FLS的迁移和侵袭能力明显增强(P < 0.05);相对于PMPs组,PMPs+Gen组RA-FLS的迁移和侵袭能力均有所减弱,PMPs+20 μmol·L-1 Gen组与PMPs组相比差异无统计学意义(P > 0.05),而PMPs+Gen(40、60 μmol·L-1)组与PMPs组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。上述结果提示,Gen可抑制PMPs诱导的RA-FLS的迁移和侵袭。
2.3 Gen抑制PMPs作用后RA-FLS与ECM的黏附如Fig 4所示,PMPs组RA-FLS与3种不同ECM模拟物的黏附能力高于空白组(P < 0.05);而PMPs+Gen组RA-FLS与ECM的黏附能力均低于PMPs组,其中PMPs+ Gen(40、60 μmol·L-1)组与PMPs组相比,差异有统计学意义(P < 0.05)。结果提示,Gen可以抑制PMPs诱导的RA-FLS与ECM的黏附。
2.4 Gen影响PMPs诱导的RA-FLS肌动蛋白细胞骨架的重排Fig 5的细胞免疫荧光染色结果显示,与空白组相比,PMPs组RA-FLS的应力纤维明显变细、变少,片状伪足增多;与PMPs组相比,PMPs+Gen组RA-FLS的片状伪足减少,应力纤维增粗。结果提示,PMPs可能通过改变肌动蛋白细胞骨架重塑,促进RA-FLS的迁移和侵袭,而Gen可通过影响RA-FLS的肌动蛋白细胞骨架装配,达到抑制PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭的作用。
2.5 Gen对PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影响Fig 6的Western blot结果显示,与空白组相比,PMPs可上调RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表达;与PMPs组相比,PMPs +Gen组RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表达下调。提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信号通路,从而进一步抑制RA-FLS的迁移和侵袭。
3 讨论RA的病理特征包括关节滑膜炎及滑膜衬里层增生,FLS的增殖和向关节软骨表面迁移和侵袭在RA病程的演变、炎症的维持以及软骨与骨的破坏等过程中,都发挥了重要作用[1, 9-10]。
本课题组为明确Gen对PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭的作用,首先采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活力,发现PMPs +Gen组细胞活力相较于空白组和PMPs组,差异均无统计学意义,排除了Gen对细胞活力的影响导致的迁移和侵袭能力改变的可能性。然后,本研究通过Transwell细胞迁移和侵袭实验,观察Gen对PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭的影响。结果表明,PMPs组RA-FLS的迁移和侵袭能力高于空白组,而PMPs +Gen组RA-FLS迁移和侵袭的能力较PMPs组有所减弱。上述结果提示,在PMPs作用的基础上,Gen能够抑制PMPs诱导的RA-FLS的迁移和侵袭。在细胞迁移和侵袭的过程中,由于细胞必须先从黏附的ECM上脱落,然后再于新部位的黏附,因此,细胞与ECM黏附的改变是细胞发生迁移和侵袭的前提[11-12]。我们分别以CollagenⅠ、Fibronectin和Matrigel作为ECM模拟物,观察Gen对PMPs作用后RA-FLS与ECM黏附的影响。结果表明,PMPs可促进RA-FLS与3种不同ECM的黏附,加入Gen后,PMPs诱导的RA-FLS与ECM类似物的黏附能力均下降,提示Gen可以抑制PMPs诱导的RA-FLS与ECM的黏附。
有研究表明,Gen可通过重构细胞中肌动蛋白细胞骨架,减少伪足的形成,抑制肿瘤细胞与ECM的黏附、迁移和侵袭[12-13]。我们采用罗丹明标记的鬼笔环肽对RA-FLS的纤维状肌动蛋白(filament actin, F-actin)骨架系统进行免疫荧光染色,观察PMPs和Gen对RA-FLS的肌动蛋白细胞骨架装配的影响。结果显示,PMPs作用于RA-FLS后,RA-FLS的应力纤维明显变细、变少,片状伪足增多,提示PMPs可能通过改变肌动蛋白细胞骨架的重塑,促进RA-FLS的迁移和侵袭。在PMPs作用的基础上加入Gen后,RA-FLS的应力纤维增粗,片状伪足减少,提示Gen可通过影响RA-FLS的肌动蛋白细胞骨架装配,达到抑制PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭的作用。
NF-κB作为重要的核转录因子,与细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭密切相关,而NF-κB通路的活化能够提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[14-15]。本课题组前期工作已证实,PMPs可通过活化NF-κB通路,促进RA-FLS的迁移和侵袭[3-4]。为进一步观察Gen对PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影响,本研究采用Western blot检测NF-κB信号通路组分蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,PMPs可上调RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表达,而对IκB、NF-κB无明显影响;与PMPs组相比,PMPs +Gen组RA-FLS中IκB和NF-κB的磷酸化受到抑制,提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信号通路,从而进一步抑制RA-FLS的迁移和侵袭。
综上所述,Gen可通过抑制PMPs激活的NF-κB信号通路,影响RA-FLS的肌动蛋白细胞骨架装配,从而抑制PMPs诱导的RA-FLS与ECM的黏附、迁移和侵袭。本研究揭示了Gen在PMPs诱导的RA-FLS迁移和侵袭过程中的作用及其机制,为寻找RA的药物靶点和机制研究提供了方向。
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