2. 山西医科大学药学院，山西 太原 030001
2. College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
近年来研究发现，蛋白激酶C(protrin kinase C, PKC)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Rho-associated kinase, ROCK)在心血管系统的多种细胞中特异性表达。PKC、Rho激酶信号通路的激活与糖尿病肾病、肿瘤、心脏病、高血压，甚至神经损伤性疾病的发生、发展密切相关，但由于PKC、Rho激酶在体内分布广泛，涉及生理功能较复杂，以该靶点做为药物的潜在不良反应较多，很难在临床上广泛应用。卡托普利做为血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACE)，目前是治疗原发性和肾性高血压的首选药物，它能抑制循环中血管紧张素Ⅰ(angiotensinⅠ, AngⅠ)变为血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)，使AngⅡ对血管的收缩作用减弱[1-2]。有资料显示，AngⅡ作为Rho激酶的激动剂可激动Rho激酶，引起血管收缩，而PKC在原发性高血压中活性增高，可导致肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度激活[3-4]，那么卡托普利舒张血管的作用是否有PKC、Rho激酶的参与呢？这是本实验研究的主要目的。虽然有实验对卡托普利舒张心脏和肾动脉作用进行了基础研究[5]，但未就PKC、Rho激酶进行研究。本实验拟使用大鼠胸主动脉，运用离体器官恒温灌流装置，观察卡托普利对大鼠离体胸主动脉环舒张效应，研究PKC、Rho激酶是否参与卡托普利的舒血管作用，进一步探讨其舒张血管作用的其他可能机制，为卡托普利新的临床应用及进一步开发利用提供理论基础。
1 材料 1.1 实验动物SD♂大鼠，体质量(225±25)g，山西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(晋)2009-0001。
1.2 试剂乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、HEPES购自上海生物工程有限公司；左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester, L-NAME)、吲哚美辛(indometacin, Indo)、苯肾上腺素(phenylephrine, PE)、佛波醇酯(phorbol ester, PMA)、十字孢碱(staurosporine, SP)、花生四烯酸(arachidic acid four arachidic acid, AA)、法舒地尔(fasudil)、卡托普利，均购自美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯，购自武汉博士德公司。生理盐溶液(physiological salt solution, PSS)液配制成分：NaCl 144 mmol·L-1、KCl 5.8 mmol·L-1、CaCl2 2.5 mmol·L-1、MgCl2 4.2 mmol·L-1、葡萄糖11.1 mmol·L-1、HEPES 5 mmol·L-1，pH 7.4。
1.3 仪器HSS-1B数字式超级恒温浴锅(成都仪器厂)；微量进样器(上海求精生化试剂仪器有限公司)；Power Lab生物信号采集分析系统、张力记录仪(澳大利亚埃德公司)。
2 方法 2.1 大鼠胸主动脉血管环的制备SD大鼠麻醉处死，开胸取出胸主动脉，置于饱和O2的4℃ PSS液中，去除周围结缔组织后，剪成3~4 mm长度的小血管环。用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔，水平悬挂于10 mL浴漕内，下方固定，上方以1根细钢丝连于张力换能器上，检测其张力变化。浴管内持续通入纯O2，加入37 ℃ PSS液5 mL，保持浴管温度为37℃。调节血管张力为2 g，保持1 h，每15 min换液1次。
2.2 血管内皮功能的检测使用细棉花棒去除内皮，轻轻穿过胸主动脉血管环，来回摩擦2次。待血管稳定后，加入60 mmol·L-1 KCl PSS液刺激血管，连续刺激稳定后，即刺激2次所引起的收缩幅度差小于5%后，加入PE(终浓度为1×10-6 mol·L-1)预收缩，稳定后加入ACh(1×10-5 mol·L-1)。若舒张幅度大于收缩幅度的80%，则视为内皮完整，舒张幅度小于收缩幅度的5%，则视为内皮去除完全[5]。
2.3 基础状态下卡托普利对离体大鼠主动脉环的影响待血管稳定后，对基础状态下的大鼠胸主动脉环，加入累积浓度卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4 mol·L-1)，观察血管张力的改变。每次加药都在上一浓度药物作用完全达到平衡后，开始下一浓度实验。
2.4 累积浓度卡托普利对KCl、PE预收缩下内皮完整和去内皮血管环的影响设置对照组、实验组，对照组加入等容量溶剂，实验组采用累积加药法加入浓度梯度的卡托普利。检查内皮功能后，经60 mmol·L-1KCl PSS溶液刺激，张力平衡后，用PSS溶液清洗，至血管环张力恢复基本张力水平。加入PE(10-6 mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)预收缩后，加入累积浓度的卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4 mol·L-1)，每次加药都是在上一浓度药物作用完全达到平衡后，开始下一浓度实验。以加入10-6 mol·L-1 PE或60 mmol·L-1 KCl诱发的血管环的最大收缩幅度为100%，计算加入卡托普利后，血管舒张幅度占最大收缩幅度的百分比，即加药后舒张幅度与10-6 mol·L-1 PE或60 mmol·L-1KCl诱发的血管环最大收缩幅度的百分比。
2.5 L-NAME、Indo对卡托普利舒张血管作用的影响血管环经内皮检测稳定后，加入L-NAME(10-4 mol·L-1)、Indo(10-5 mol·L-1)孵育25 min，用PE(10-6 mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)预收缩血管，预收缩达到坪值后，加入累积浓度的卡托普利。对照组不孵育L-NAME、Indo，直接加PE(10-6 mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)预收缩血管，达到坪值后，直接加入累积浓度的卡托普利。每次加药都是在上一浓度药物作用完全达到平衡后，开始下一浓度实验，记录相应血管环张力并计算变化值。
2.6 外钙内流对卡托普利舒张血管作用的影响血管预刺激、检测内皮稳定后，用含EGTA的无钙PSS液洗脱血管20 min，待血管稳定，用无钙PSS(不含EGTA)洗脱10 min后，加入无钙KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min，再加入2.5 mmol·L-1 CaCl2，血管达坪值后，依旧用含EGTA的无钙PSS液洗脱血管20 min，无钙PSS (不含EGTA)洗脱10 min，向水浴槽中分别加入卡托普利(10-6、10-5、10-4 mol·L-1)，孵育15 min，换液体为无钙KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min，再加入2.5 mmol·L-1 CaCl2。以孵育卡托普利前含钙液中KCl(60 mmol·L-1)的收缩幅度为100 %。
2.7 PKC、Rho激酶对卡托普利舒张血管作用的影响采用内皮完整大鼠胸主动脉环，经60 mmol·L-1 KCl PSS溶液刺激，张力平衡后，用PSS溶液清洗，待张力恢复到刺激前稳定水平，分别加入PKC特异性抑制剂十字孢碱(3×10-8 mol·L-1)、激动剂PMA(10-7 mol·L-1)或Rho激酶抑制剂fasudil(2×10-6 mol·L-1)或激动剂AA(10-9 mol·L-1)预孵25 min后，用PE(10-6 mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)预收缩血管，达到坪值后，加入累积浓度的卡托普利，对照组为预收缩达到坪值后直接加入卡托普利，记录相应的血管环张力变化。
2.8 统计学处理应用SPSS 20.0及Graph Pad Prism 6软件进行统计学处理，结果以x±s表示，进行t检验分析。
3 结果 3.1 基础状态下卡托普利对离体大鼠主动脉环的影响卡托普利累积系列浓度(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4 mol·L-1)时，对基础状态下的血管张力无明显影响，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of captopril on basic tension of normal rat aortic rings(x±s, n=6) |
卡托普利对KCl(60 mmol·L-1)、PE(10-6 mol·L-1)预刺激的血管环具有浓度依赖性的舒张作用，且内皮完整组和去内皮组卡托普利最大浓度的舒张程度分别为(0.160±0.013)和(0.084±0.009)、(0.407±0.058)和(0.140±0.048)。空白对照组对血管张力几乎无影响。内皮组、去内皮组与对照组两相比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，且内皮组与去内皮组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，内皮完整组舒张程度大于去内皮组(Fig 2、3)。
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| Fig 2 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium- intact (End+) or -denuded (End-) rat aorta rings precontracted with KCl (x±s, n=6) Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 60 mmol·L-1 of KCl. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs End+ +captopril group. |
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| Fig 3 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded(End-) rat aorta rings precontracted with PE (x±s, n=6) Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 10-6 mol·L-1 PE. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs End+ + captopril group. |
KCl预收缩下，L-NAME(10-4 mol·L-1)、Indo(10-5 mol·L-1)组中，卡托普利产生的最大舒张程度为(0.071±0.010)和(0.062±0.029)。与对照组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 4A。PE预收缩下，L-NAME(10-4 mol·L-1)、Indo(10-5 mol·L-1)组中，卡托普利的最大舒张程度为(0.142±0.028)和(0.171±0.032)。与对照组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 4B。
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| Fig 4 Effect of L-NAME and Indo on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl(A) or PE(B) (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs captopril group |
无钙PSS液体中，KCl(60 mmol·L-1)几乎不引起血管环收缩，水浴管中加入2.5 mmol·L-1 CaCl2，主动脉产生收缩，且收缩幅度与正常KCl(60 mmol·L-1)PSS液体中的收缩程度一致。而孵育卡托普利(10-6、10-5、10-4 mol·L-1)会浓度依赖性地抑制2.5 mmol·L-1 CaCl2产生的收缩，与未孵育卡托普利组相比，差异有显著性(Fig 5)。
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| Fig 5 Effect of captopril on KCl-induced contraction of isolated rat thoracic aorta rings with 2.5 mmol·L-1 CaCl2(x±s, n=6) The vessels were incubated with captopril (10-6, 10-5, 10-4 mol·L-1) and the control for 15 min before addition of KCl. *P < 0.05 vs control group |
KCl预收缩下，PKC抑制剂SP和PKC激动剂PMA组中，卡托普利产生的最大舒张程度为(0.296±0.031)和(0.077±0.013)。与卡托普利组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 6A。PE预收缩下，PKC抑制剂SP和PKC激动剂PMA组中，卡托普利产生的最大舒张程度为(0.741±0.104)和(0.261±0.057)。与卡托普利组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 6B。
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| Fig 6 Effects of PKC on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl (A)or PE (B) (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs captopril group |
KCl预收缩下，Rho激酶抑制剂fasudil和Rho激酶激动剂AA组中，卡托普利产生的最大舒张程度为(0.251±0.042)和(0.072±0.009)。与卡托普利组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 7A。PE预收缩下，Rho激酶抑制剂fasudil和Rho激酶激动剂AA组中，卡托普利产生的最大舒张程度为(0.849±0.068)和(0.159±0.022)。与卡托普利组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 7B。
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| Fig 7 Effects of Rho kinase on thoracic aortic vascularization in captopril-induced relaxation rats under precontraction of KCl(A) or PE(B) (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs captopril group |
卡托普利是抗高血压的一线用药，其具有明确的舒张血管、降低血压的作用。目前已发现，卡托普利在冠脉和肾动脉上，对KCl引起的收缩均无明显影响，说明其舒张血管的机制与电压依赖型钙通道无关。使用L-NAME和Indo阻断一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和环氧酶(cyclooxygenase, COX)之后，发现卡托普利可抑制血栓素A2的作用，促进前列环素释放，部分抑制NOS的作用，说明其对冠脉和肾动脉的舒张作用与内皮NO系统相关[5]。由于卡托普利舒张血管的作用机制较为复杂，本实验采用大鼠胸主动脉，进一步研究卡托普利对大动脉血管舒张作用及其与NO的相关性，同时观察外钙内流、PKC和Rho激酶对其的影响。
本实验结果显示，卡托普利对基础状态大鼠胸主动脉张力无明显作用。在KCl和PE预刺激下，内皮完整组和去内皮组均对大鼠胸主动脉有浓度依赖性舒张作用，且内皮完整组舒张程度大于去内皮组，提示卡托普利对血管的舒张作用大部分是通过内皮途径完成。在本实验中发现，分别孵育NOS抑制剂L-NAME、COX抑制剂Indo后，卡托普利的舒血管作用均部分被阻断，提示NO、前列环素参与卡托普利的舒血管作用，表明卡托普利可促进前列环素和NO的释放，可能通过NO-cGMP途径舒张血管或直接使收缩蛋白去磷酸化来舒张血管[7]。
原发性高血压中其钙动员异常，细胞外钙内流是影响钙动员原因之一。外钙内流通道有受体调控型钙通道和电压门控型钙通道[8-9]。60 mmol·L-1 KCl引起收缩是因为高钾引起了细胞膜去极化，电压门控型钙通道开放，致使外钙内流。本实验无钙条件下，KCl预刺激，孵育卡托普利后抑制了2.5 mmol·L-1 CaCl2引起的血管平滑肌收缩，提示抑制电压门控型的钙通道开放，抑制外钙内流可能也是卡托普利对大鼠离体主动脉舒血管机制之一。
大量研究表明，高糖、高AngⅡ、氧化应激均可引起PKC活力增高[10-11]，PKC的激活在调节血管内皮细胞功能屏障、血管通透性、血管舒缩方面有重要作用，是参与高血压发病的重要信号通路。本研究结果显示，应用PKC抑制剂SP作用于大鼠胸主动脉，卡托普利的舒血管作用被加强，而应用PKC激动剂PMA作用于大鼠胸主动脉，卡托普利的舒血管作用部分被阻断，表明PKC信号通路可能参与卡托普利的舒血管作用。
在机体内多种影响因子的刺激下，体内Rho激酶会激活，激活的RhoA与ROCK结合后，增加钙调蛋白生成，使肌球蛋白轻链活化，上调磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)水平，MLC20的磷酸化水平，可影响血管收缩[12]。研究发现，Rho激酶表达上调导致的功能性血管收缩与高血压的发病有明显相关性，抑制Rho激酶可以阻断AngⅡ诱导的MLC磷酸化增加和p-MLC去磷酸化抑制，促进小动脉舒张。本实验应用ROCK抑制剂fasudil作用于大鼠胸主动脉，卡托普利的舒血管作用增强，而使用ROCK的激动剂AA后，卡托普利的舒血管作用减弱，表明Rho激酶信号通路可能参与卡托普利的舒血管作用。有证据表明，在同一细胞内信号通路中，PKC在Rho激酶上游发挥作用[13]，故卡托普利可能通过抑制PKC-Rho激酶信号通路，发挥对血管的舒张作用。
综上所述，卡托普利的舒张血管环作用可能与NO-cGMP途径、前列环素通路及外钙内流相关，同时其可能通过抑制PKC-Rho激酶信号通路，参与其舒张作用。卡托普利虽已在临床上治疗高血压应用多年，但对PKC、Rho激酶与卡托普利的相关性只进行了初步研究，具体信号通路机制将需进一步的深入研究。
( 致谢: 本实验在山西医科大学基础医学院药理教研室完成，感谢张明升教授及药理学教研室各位老师的帮助。)
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