2. 西安医学院第一附属医院中心实验室，陕西 西安 710077;
3. 西安医学院2014级临床药学四年制，陕西 西安 710077
2. Det of Central Lab, the First Affiliated Hospital, Xi'an Medical University, Xi'an 710077, China;
3. Clinical Medicine (Four-year Program) of Grade 2014, Xi'an Medical University, Xi'an 710077, China
肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈增高趋势[1]。目前，临床上尚未明确原发性肝癌的发病机制，临床治疗以手术、化疗、放疗等为主，但预后差、副作用大等特点使得急需一种新的治疗策略[2]，迷迭香酸(rosmarinic acid, RosA)是一种水溶性的酚酸类化合物，在植物中广泛分布，尤以唇形科和紫草科含量最高[3]。RosA具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肾小球细胞增殖、抗抑郁等多种药理作用[4-5]。RosA在癌症的预防和治疗中也有大量研究，研究表明，RosA可通过抑制炎症反应，抑制肿瘤的发生与发展[6]。波形蛋白(Vimentin)是中间纤维的主要组成部分，参与肿瘤的发生和转移。研究表明，Vimentin是联系“炎癌转化”的重要分子，可驱动NLRP3炎症小体/caspase-1炎症信号[7]。然而，RosA是否通过Vimentin/NLRP3影响肝癌细胞的增殖及凋亡，尚未见报道。因此，本研究通过观察RosA对HepG2细胞增殖、凋亡及Vimentin/NLRP3蛋白表达的影响，探讨RosA防治肝癌的作用机制，为其进一步开发应用提供实验基础。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人肝癌细胞系HepG2为西安医学院第一附属医院中心实验室保存。小牛血清(四季青生物工程工司)；RosA购自美国Signal Chemical公司；RPMI 1640培养基(Gibco公司)；MTT检测试剂盒购自北京赛驰公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)；抗GAPDH、Vimentin、NLRP3、Bcl-2、caspase-3抗体，均购自Santa Cruz公司；TNF-α、IL-β ELISA试剂盒，购自Abcam公司。
1.2 MTT法检测细胞增殖HepG2细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。将处于对数生长期的细胞，以5×104·L-1接种至96孔板中培养24 h。将细胞分为对照组和RosA处理组(25、50、100 μmol·L-1)，置培养箱中培养48 h。各组细胞处理结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μL，置培养箱中继续培养4 h后，吸弃上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，摇床低速振荡10 min，使各孔结晶物充分溶解, 采用全自动酶标仪在570 nm处测各孔OD值。细胞增殖抑制率=(1-处理组A值/对照组A值)×100%。
1.3 TUNEL法检测细胞凋亡采用细胞凋亡试剂盒，按照试剂盒说明书操作，ABC染色法，DAB显色，苏木精轻度复染、脱水、透明、封片。细胞核中出现棕黄色颗粒为原位末端标记阳性细胞，即凋亡细胞。采用显微镜计数法，观察每个高倍视野的凋亡细胞数，随机选取3张切片，每张切片6个视野，凋亡指数(apoptosis index, AI)=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 Western blot检测相关蛋白的表达收集各组细胞，用预冷PBS洗涤2次，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液500 μL，混匀，4℃、1 300 r·min-1离心15 min, 取上清，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg等量蛋白上样。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h, TBST洗涤3次，每次5 min。加入一抗Vimentin(1 :300)、NLRP3(1 :500)、Bcl-2 (1 :500)、caspase-3 (1 :1 000)、GAPDH(1 :500)，4℃孵育过夜。次日TBST洗涤3次，每次5 min, 加入辣根过氧化酶标记的二抗(1 :1 000)，室温孵育2 h，洗膜后显色，凝胶成像分析系统扫描分析。以GAPDH为内参，计算各组目的蛋白的表达水平。
1.5 ELISA法检测TNF-α和IL-β的表达细胞培养及分组方法如前，将处理好的细胞加入ELISA试剂盒的96孔板中，每孔加入100 μL，盖上封纸，置于37℃孵育2 h。孵育结束后，移出液体，不清洗，每孔加100 μL稀释后的检测试剂A，封口，置于37 ℃孵育1 h, 孵育结束后，移出液体，用350 μL的洗脱液将96孔板洗3次，每次清洗液在孔中停留1~2 min，吸干液体，于每孔加100 μL稀释后的检测试剂B，封口，37℃孵育30 min，结束后，移出液体，用350 μL洗脱液将96孔板洗4次，洗脱方法如前，吸干液体，于每孔中加90 μL底物溶液，盖上封纸，孵育20 min，结束后，于每孔加入50 μL终止液终止反应，酶标仪在450 nm波长处测吸光度值。
1.6 统计学处理用SSPS 16.0统计软件对数据进行统计处理，数据以x±s表示，组间比较用F检验。
2 结果 2.1 RosA对HepG2细胞增殖的影响RosA处理HepG2细胞48 h后，Fig 1的MTT结果显示，RosA(25~100 μmol·L-1)均能抑制HepG2细胞的增殖，且随着给药浓度的增加，RosA对HepG2细胞的增殖抑制作用明显增强(P < 0.05)。
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| Fig 1 Cell viability of HepG2 cells measured after RosA intervention (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
Fig 2的TUNEL结果显示，对照组细胞形态正常，而RosA作用于肝癌HepG2细胞后，细胞核颜色为黄色，染色质皱缩，细胞形态无规则，凋亡指数随浓度增加而升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)。Fig 3的Western blot结果表明，RosA能下调Bcl-2蛋白的表达，上调caspase-3蛋白的表达，且呈剂量依赖性。
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| Fig 2 Effect of RosA on apoptosis of HepG2 cells(x±s, n=3) A:TUNEL results (×200); a: Control; b: RosA 25 μmol·L-1; c: RosA 50 μmol·L-1; d: RosA 100 μmol·L-1. B: Apoptotic index. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
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| Fig 3 Effects of RosA on Bcl-2 and caspase-3 protein expression in HepG2 cells (x±s, n=3) A: Western blot results; B: The quantitative data of Bcl-2 and caspase-3. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 4所示，与对照组相比，RosA组均能明显降低肝癌HepG2细胞中Vimentin及NLRP3蛋白表达(P < 0.05)，且呈剂量相关性。
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| Fig 4 Effect of RosA on expression of Vimentin and NLRP3 in HepG2 cells (x±s, n=3) A: Western blot results; B: The quantitative data of Vimentin and NLRP3. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
为了进一步验证Vimentin对NLRP3的作用，本研究检测了NLRP3下游炎症因子TNF-α和IL-β的表达。如Fig 5所示，与对照组相比，RosA组TNF-α和IL-β的水平均下降，且呈浓度依赖性。
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| Fig 5 Effects of RosA on levels of TNF-α and IL-β in HepG2 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
我国每年约有11~13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。肝癌的发病率和死亡率高，预后效果不理想，因此，迫切需要寻找一种有效的临床治疗方法[8]。某些中成药提取物具有广谱、低毒的抗肿瘤作用，因此，受到广泛的关注。RosA是一种水溶性多酚羟基化合[9]，广泛参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为，杨沛霖等[10]研究表明，RosA能够抑制CNE-1细胞增殖，并诱导其凋亡，其机制与调控PTEN、PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。任为等[11]研究也表明，RosA能通过诱导凋亡、抑制NF-κB通路活性，在肝癌H22移植瘤小鼠体内发挥抗肝癌作用。本课题组前期研究发现，RosA能抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭能力，HBx在RosA干预下，能促进HepG2细胞的凋亡[12]。本研究采用RosA(25、50、100 μmol·L-1)作用于HepG2细胞，结果表明，不同浓度组对HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。
肿瘤的发生与炎症反应密切相关，肿瘤的免疫治疗以及肿瘤微环境的影响受到越来越多的关注。炎症小体是由胞质内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，能启动和参与炎症反应的核心环节，其中NLRP3炎症小体是目前研究较多的炎症小体，与多种肿瘤发生进程关系密切，包括胃癌、直肠癌、肝癌等。而其活化机制尚不明确，有研究表明，活性氧(reactive oxygen species, ROS)、钾离子外流模型、脂肪酸等代谢产物均能使其活化。近年来研究发现，Vimentin也可能是NLRP3炎症小体的关键调控因子，在组织损伤和纤维化过程中发挥作用。Vimentin是一种在间质中表达的Ⅲ型中间丝蛋白，在细胞分裂时对染色体起支架的作用，在众多上皮来源的恶性肿瘤组织或癌细胞株中过度表达，作为一种重要的信号分子和转录因子，参与肿瘤的发生和转移。卓少元等[13]研究发现，caspase-3可下调细胞中Vimentin蛋白表达，抑制肝癌细胞的增殖与侵袭。王红光等[14]研究发现，Vimentin与NF-κB在恶性胶质瘤中高表达，协同基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)高表达，促进肿瘤迁移及侵袭。而未见Vimentin与NLRP3在肝细胞增殖及凋亡方面的报道。本研究结果表明，不同浓度RosA均能降低肝癌HepG2细胞Vimentin及NLRP3蛋白表达，为进一步验证Vimentin对NLRP3的激活作用，我们检测了NLRP3下游炎症因子TNF-α和IL-β的表达，结果表明，其下调趋势与RosA引起的NLRP3下调趋势一致。提示RosA能降低肝癌细胞的增殖及凋亡，其作用机制与Vimentin激活NLRP3炎症通路有关。
综上所述，RosA能剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖，并诱导其凋亡，其机制可能与调控Vimentin/NLRP3信号通路有关。根据本文的结果，我们将继续进行后续动物实验，以深入确定RosA治疗肝癌的机制，进一步推进RosA在临床上的应用。
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