表1(Table 1)
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致心脑血管事件发生的关键因素, 其特点是动脉血管壁脂质沉积、增厚、形成斑块，造成管腔堵塞，导致受阻动脉远端组织、器官缺血和坏死，进而发生心肌梗死、脑卒中等严重后果[1]。AS发生、发展机制十分复杂，现代医学认为是脂质代谢异常、内皮损伤、炎症、氧化应激等因素相互作用的结果。目前，临床用于治疗AS药物包括调节血脂、扩张血管、抗血小板黏附和聚集、溶解血栓和抗凝的药物等，其中，他汀类药物能够降低血脂、减少炎症、抑制血小板聚集与抗血栓、改善内皮功能、稳定并逆转斑块等，被认为是心血管疾病重要的预防和治疗药物[2]。但是，西药长时间服用毒副作用大、易产生药物抵抗，且费用较高，而中药能从多个靶点发挥药理作用，且毒副作用小，在防治动脉硬化方面已逐渐得到了广泛认可。
三七总皂苷(total saponins of panax notoginseng, PNS)是五加科人参属植物三七根部提取的有效活性成分, 具有活血祛瘀、通脉活络、抑制血小板聚集、增加心脑血流量的功能, 临床广泛用于心脑血管疾病的治疗[3]。PNS治疗AS的研究性报道很多，其主要通过有效抑制泡沫细胞形成、保护血管内皮细胞、调节血脂与抑制炎症因子、粥样斑块稳定作用等途径，发挥治疗AS的作用[4]。本研究通过载脂蛋白E基因敲除(ApoE-KO)小鼠AS模型，观察了PNS对血脂的调节、血管内皮保护、炎症因子的抑制、动脉斑块的稳定作用，证实了PNS对AS的治疗作用。
1 材料 1.1 实验动物SPF级C57BL/6 ApoE-KO小鼠，♂，6周龄，购于北京维通利华实验动物有限公司。动物许可证号: SCXK(京)-20160011。
1.2 药物与试剂PNS(9.1% R1、35.2% Rg1、32.7% Rb1、4.7% Re、7.5% Rd)，由昆药集团股份有限公司提供，批号：SKQZ2017032；阿托伐他丁钙(美国Sigma-Aldrich公司，批号：LRAA9204)。4%多聚甲醛(北京鼎国, 批号：AR-0211)；RNA Later RNA Stabilization Reagent(德国QIAGEN公司，批号：76106)；TUNEL试剂盒(南京凯基生物，批号：20171010)；氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidized low density lipoprotein, oxLDL-C)ELISA试剂盒(美国Cloud-Clone Corp，批号：L170824945)；EasyPure RNA Kit(北京全式金生物技术有限公司，批号：ER101-01)；All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(亚太恒信生物科技北京有限公司，批号：AORT-100)；TaqManTM Gene Expression Master Mix(美国Thermal Fisher公司，批号：4369016)。
1.3 仪器7180生化自动分析仪(日本日立公司)；5424R离心机(德国Eppendorf公司)；CM1950冷冻切片机(德国Leica公司)；BX43显微镜(日本Olympus公司)；Nikon-Ni-U显微镜(日本Nikon公司)；7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。
2 方法 2.1 实验动物分组与给药ApoE-KO小鼠适应性饲养1周后，检测空腹血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)，并按照TC水平随机分为6组(每组12只)：对照组、模型组、PNS低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg-1)、阿托伐他汀钙组(20 mg·kg-1)。除对照组外，其余各组动物均给予高脂饮食喂养(含1.5%胆固醇、21%脂肪；美国Research Diets公司, 货号：D12079B)，建立AS模型。8周后开始给药，PNS用PEG400配制，阿托伐他汀钙用生理盐水配制，均灌胃8周。
2.2 血样采集及生化分析实验开始第0、8、12、16周，取血检测小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和oxLDL-C含量变化。小鼠禁食过夜后，通过下颌采血或心脏采血(终点)收集血液(150 μL)，室温放置2 h。4℃、7 000 r·min-1离心10 min，得到血清，检测上述生化指标。
2.3 动脉分离及Enface检测实验结束时，每组取6只小鼠，通过CO2吸入进行安乐死，并用20 mL生理盐水通过左心室进行灌流。心脏及主动脉(从主动脉弓到髂动脉)被完整分离。离体的动脉由主动脉弓到髂动脉纵向剖开，置于4%多聚甲醛固定30 min，经60%异丙醇同步化10 min后，置于60%油红中染色30 min，60%异丙醇洗涤3次，每次5 min。着色的动脉用去离子水洗净后拍照。通过Image Pro Plus 6.0软件测量红色斑块区域的比例。
2.4 动脉mRNA表达的检测每组剩余6只小鼠用于细胞因子mRNA检测。主动脉被完整分离后，浸入存有RNA later稳定溶液的离心管中，置于4℃冰箱过夜，再移入-20℃冰箱保存, 待检测。使用Thermofisher公司TaqMan基因表达分析系统，由1对未标记的PCR引物与1条TaqMan探针组成，见Tab 1。提取组织RNA后，将RNA逆转录生成的cDNA作为模板进行扩增。荧光定量PCR扩增反应体系(25 μL):2×Master Mix 12.5 μL，目的基因引物/探针混合物和GAPDH引物/探针混合物各1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。反应条件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环45次。2-ΔΔCt法分析各组小鼠目的基因的相对表达量。
| SN | Gene | Cat (ID) |
| 1 | ICAM-1 | Mm00516023_m1 |
| 2 | GAPDH | Mm99999915_g1 |
| 3 | VCAM-1 | Mm01320970_m1 |
| 4 | iNOS | Ec03467508_m1 |
| 5 | NOS3 | Mm00435217_m1 |
| 6 | COX-2 | Mm03294838_g1 |
| 7 | CRP | Mm00432680_g1 |
| 8 | TNF-α | Mm00443258_m1 |
| 9 | IL-1β | Mm00434228_m1 |
| 10 | IL-6 | Mm00446190_m1 |
每组取6只小鼠用于左心室流出道病理评分。小鼠心脏样本经甲醛溶液固定过夜后，蔗糖溶液脱水。在体视显微镜下用OCT进行包埋，并制作成7 μm的冷冻切片。切片经HE染色后，用于常规病理检测，通过光学显微镜×40倍数下采集流出道图像。同时，在显微镜下测量左心室流出道的斑块区域，计算左心室流出道的斑块比例，以反映斑块厚度及血管狭窄。检测标准参照人类动脉粥样硬化疾病组织学分型标准，见Tab 2。
| Classification | Description |
| Type Ⅰ (preliminary stage) | Isolation of macrophage foam cells |
| Type Ⅱ (fatty streak) | Accumulation of lipid in cells |
| Type Ⅲ (mid-term) | Type Ⅱ, and formation of small area of the extracellular lipid |
| Type Ⅳ (atheromatous plaque) | Type Ⅱ, and formation of lipid core |
| Type Ⅴ (fibrous plaque) | Formation of lipid core and fibrous layer, a variety of lipid core and fibrous layer, or calcification and fibrosis |
| Type Ⅳ (complex lesion) | Rupture of surface, hematoma-hemorrhage, thrombus |
| Type Ⅴ is divided into three sub-types: Type Ⅴa, named as thin-cap fibroatherom which has lipid core and fibrosis tissue; Type Ⅴb, without lipid core and fibrosis tissue, but with calcification; Type Ⅴc, without lipid core, but shows stable plaques. Type Ⅵ is divided into three sub-types: Type Ⅵa, rupture of lesion surface; Type Ⅵb, hemorrhage; Type Ⅵc, thrombus. | |
心脏左心室流出道用OCT包埋并制作成冷冻切片。严格按照TUNEL试剂盒说明操作，TUNEL染色结束后，滴加DAPI孵育5 min，抗荧光猝灭剂封片，采用荧光显微镜观察并拍照。镜下观察绿色荧光为TUNEL阳性细胞，蓝色荧光为DAPI对所有细胞核进行染色。利用Image-Pro Plus6.0图像分析软件, 计数阳性细胞及区域内总细胞, 计算阳性细胞百分比, 即为凋亡指数。
2.7 数据分析使用GraphPad Prism Software 5.0进行作图和数据处理。使用Grubb’s test进行离群值检验，统计分析时将离群值剔除。数据以x±s表示，通过One-way或two-way ANOVA post-hoc Dunnett’test进行组间比较。
3 结果 3.1 PNS对ApoE-KO小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影响Tab 3结果显示，第16周时，与对照组相比，模型组小鼠血清TC、LDL-C、HDL-C水平明显增高，TG水平有增高的趋势；与模型组相比，PNS(100、200 mg·kg-1)组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均有降低的趋势。
| Group | Dose/mg·kg-1 | TC/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 | LDL-C/mmol·L-1 | HDL-C/mmol·L-1 |
| Control | - | 13.83±0.59 | 1.06±0.07 | 9.59±0.48 | 4.47±0.11 |
| Model | - | 25.89±1.54 ## | 1.11±0.05 | 21.52±1.06## | 7.62±0.35## |
| PNS | 50 | 25.29±1.60 | 0.85±0.09 | 21.48±1.23 | 7.61±0.42 |
| 100 | 20.63±1.97 | 0.76±0.05 | 17.95±1.26 | 7.11±0.35 | |
| 200 | 19.87±1.47 | 0.71±0.05 | 17.59±1.24 | 7.46±0.32 | |
| Atorvastatin | 20 | 20.37±1.58 | 1.03±0.07 | 15.83±1.26* | 6.59±0.32 |
| ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model | |||||
oxLDL-C被认为是AS发生的危险因素。如Fig 1所示，虽然模型组小鼠血清oxLDL-C水平与对照组相比差异没有统计学意义，但PNS(50、100、200 mg·kg-1)给药后能明显降低血清oxLDL-C水平。
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| Fig 1 Effects of PNS on serum content of oxLDL-C in ApoE-KO mice (x±s，n=12) *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group |
AS的病变与血栓的形成密切相关。如Fig 2所示，模型组小鼠的粥样硬化斑块面积占比是8.08%，明显高于对照组(1.47%)。PNS给药后对形成的动脉斑块有稳定和缓解的趋势。
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| Fig 2 Effects of PNS on atherosclerotic plaque and representative graph by oil red staining A: Oil red staining; B: Percentage of the atherosclerotic plaque in ApoE-KO mice (x±s，n=6). ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 vs model group. |
对照组小鼠的左心室流出道内膜光滑无增厚，管壁膜内无脂质沉淀；模型组小鼠的主动脉血管壁明显增厚，可见斑块和管腔狭窄；与模型组比较，PNS给药后左心室流出道内膜增厚和斑块情况有一定改善(Fig 3)。
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| Fig 3 Representative graph of left ventricular outflow tract by HE staining A: Control; B: Model; C: Atorvastatin 20 mg·kg-1; D: PNS 50 mg·kg-1; E: PNS 100 mg·kg-1; F: PNS 200 mg·kg-1. |
按照人类动脉粥样硬化疾病组织学分型标准进行的形态学评估显示，各组流出道病理分型均在IV-Vb之间，除对照组外，各组之间组织学分型差异无显著性(Tab 4)。通过表面区域测量，模型组流出道损伤面积明显高于对照组，PNS给药后对流出道损伤具有一定的改善作用(Fig 4)。
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| Fig 4 Percentage of lesion area in left ventricular outflow tract of ApoE-KO mice (x±s，n=6) ##P < 0.01 vs control group |
| Group | Dose /mg·kg-1 |
Type of outflow tract | ||
| IV | Va | Vb | ||
| Control | - | 2 | 4 | 0 |
| Model | - | 0 | 6 | 0 |
| PNS | 50 | 0 | 5 | 1 |
| 100 | 0 | 5 | 1 | |
| 200 | 0 | 6 | 0 | |
| Atorvastatin | 20 | 0 | 4 | 2 |
心脏左室流出道内斑块的堆积会导致内皮细胞坏死、凋亡。如Fig 5所示，PNS(100、200 mg·kg-1)组明显改善了内皮细胞的凋亡情况。
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| Fig 5 Apoptosis of endothelial cells in left ventricular outflow tract of ApoE-KO mice (x±s，n=6) ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group |
与对照组比较，模型组细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1) mRNA表达水平有增加的趋势，PNS给药对ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达有降低的趋势(Fig 6)。
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| Fig 6 Effects of PNS on levels of ICAM-1 and VCAM-1 mRNA in aorta of ApoE-KO mice (x±s，n=6) 1:Control; 2:Model:3:PNS 50 mg·kg-1; 4:PNS 100 mg·kg-1; 5:PNS 200 mg·kg-1; 6:Atorvastatin 20 mg·kg-1 |
与对照组比较，模型组小鼠主动脉诱导型NOS (inductive NOS, iNOS) mRNA表达有增加的趋势；与模型组比较，PNS给药组iNOS mRNA表达有降低的趋势。与对照组比较，模型组小鼠主动脉内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS) mRNA表达有减少的趋势；与模型组比较，PNS给药组eNOS mRNA表达水平有增加的趋势，见Fig 7。
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| Fig 7 Effects of PNS on levels of iNOS and eNOS mRNA in aorta of ApoE-KO mice (x±s，n=6) 1:Control; 2:Model:3:PNS 50 mg·kg-1; 4:PNS 100 mg·kg-1; 5:PNS 200 mg·kg-1; 6:Atorvastatin 20 mg·kg-1 |
与对照组比较，模型组小鼠主动脉IL-1β、IL-6 mRNA表达明显增加，TNF-α mRNA的表达有增加的趋势；与模型组比较，PNS给药组IL-1β和IL-6(除PNS 100 mg·kg-1组)mRNA表达明显降低，PNS给药组(除PNS 200 mg·kg-1组)TNF-α mRNA表达有降低的趋势，见Tab 5。
| Group | Dose/mg·kg-1 | IL-1β mRNA | IL-6 mRNA | TNF-α mRNA |
| Control | - | 0.009±0.005 | 1.517±0.656 | 1.905±1.016 |
| Model | - | 0.237±0.003## | 7.125±2.936## | 2.826±1.450 |
| PNS | 50 | 0.003±0.001** | 1.398±0.452** | 2.571±0.615 |
| 100 | 0.003±0.001** | 5.088±1.778 | 1.626±0.720 | |
| 200 | 0.007±0.003** | 2.251±1.402* | 4.858±2.102 | |
| Atorvastatin | 20 | 0.012±0.005** | 3.269±1.678* | 1.255±0.502 |
| ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | ||||
AS严重危害人类健康，其形成是一个十分复杂的病理生理过程, 包括脂质代谢异常、低密度脂蛋白氧化修饰、内皮损伤、单核细胞黏附、平滑肌细胞增生以及斑块形成后不稳定因素，导致纤维帽破裂，形成血管堵塞、瘀滞等。
高血脂被认为是AS的始动因素，可引起血浆脂蛋白异常，导致动脉管壁病变。研究发现，LDL-C水平与AS的发生呈正相关, 其机制是LDL-C通过apoB100与细胞外基质相互作用，沉积在动脉内膜下，形成粥样硬化斑块[2]。本研究中，经过8周高脂饮食的ApoE-KO模型组小鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C均升高，形成明显的高脂血症和AS；在此基础上给予8周PNS，对TC、TG、LDL-C和HDL-C均有降低的趋势，表明PNS有一定的降血脂效果。HDL-C被称为“有益胆固醇”，它能够转运血液中多余的胆固醇，转移至肝脏消化代谢。LDL-C主要负责将胆固醇转运至血液中，所以被称为“坏胆固醇”。大量文献证实，LDL-C是心脏疾病的风险因子，因此，HDL-C/LDL-C比例可以用来预测心脏疾病发生风险。在实验终点时(16周)，PNS 50 mg· kg-1给药组的HDL/LDL比例为0.35，略微低于正常组(0.47)和阿托伐他汀钙组(0.42)；而PNS 100、200 mg·kg-1给药组的HDL/LDL比例分别为0.40和0.42，接近于阿托伐他汀组。因此，PNS的降脂作用可能是其预防AS作用机制之一，并可降低心脏疾病发生的风险。
LDL-C在代谢过程中产生的氧自由基氧化形成oxLDL-C，oxLDL-C导致的内皮功能障碍和炎性反应在AS的病理过程中起关键作用。oxLDL-C可引起内皮细胞结构及形态损伤，能够降低内皮细胞的抗纤溶活性和舒血管功能[5]。oxLDL-C还能够诱导内皮细胞表达多种黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、PDGF-A等), 减少eNOS的产生，增强单核细胞和T淋巴细胞的黏附及向内膜下移行，促进泡沫细胞的形成及AS斑块的发生发展。同时，oxLDL-C可刺激多种炎症因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等的表达，加速AS炎症反应[6]。虽然，在高胆固醇血症小型猪研究中发现，冠状动脉斑块的程度与斑块内总LDL和oxLDL-C有关，而与血液中oxLDL-C水平无关，即在循环中的oxLDL-C对AS影响不大[7]，但本研究仍发现，PNS可以明显降低ApoE-KO小鼠血清oxLDL-C水平，提示PNS对血管内皮的保护作用。
AS早期内皮细胞释放的VCAM-1和ICAM-1是近几年研究的热点，它们能促使单核细胞向动脉壁的迁移, 在AS的发生、发展中起重要作用。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平有增加的趋势，PNS给药后小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达有降低的趋势。提示长期灌胃PNS可降低ApoE-KO小鼠主动脉ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达，抑制AS中免疫相关细胞的黏附，从而延缓AS的进展。
近年来研究显示，一氧化氮(NO)在AS发生、发展中起重要作用，它能抑制AS过程中的许多关键步骤, 如血小板黏附聚集、黏附分子和趋化因子的表达, 以及炎性分子的释放、血管平滑肌的迁移和增殖等[8]。NOS是体内产生NO的限速酶，eNOS和iNOS是其中的两个亚型。eNOS在AS的发病机制方面有着双重作用:在正常情况下, eNOS产生低浓度的NO, 这对机体抗AS是有益的; 在高脂血症、AS时, eNOS产生更少的NO, 更多的超氧化物形成, 加之局部iNOS的活化, 后者产生的NO和过氧化物同时增加, 会导致AS斑块内高浓度、有细胞毒作用的过氧化亚硝酸盐形成, 将促进和加速AS的发生、发展。iNOS与eNOS相比, 产生NO的速度更快、量更大, NO与超氧离子结合可形成过氧亚硝酸根, 能干扰细胞内信号传导, 促进AS的发生[9]。有研究显示, iNOS主要存在于成熟AS斑块中, 而iNOS抑制剂可延缓AS的进程。因此, iNOS表达减弱或eNOS表达增强可抑制AS的形成和发展。本研究观察到，PNS能纠正AS病变中iNOS表达增多和eNOS表达减少的失衡现象, 提示其可通过对NO途径的调控, 具有一定的抑制炎症反应和内皮保护功能。同时，PNS给药后，小鼠主动脉IL-1β和IL-6 mRNA表达较模型组明显下降，TNF-α mRNA表达也有降低的趋势，提示PNS可减轻AS过程中炎性反应。
AS逆转包括两个方面：斑块面积缩小和斑块的稳定性增加。AS的后期发生了许多实质性病变，逆转斑块相对困难，寻找能稳定、甚至缩小动脉斑块的药物对更有效治疗AS十分重要[10]。本研究用电镜观察小鼠主动脉斑块形成情况、左心室流出道病理形态发现，对照组小鼠主动脉内皮光滑完整，左心室流出道管壁无损伤，无增厚和脂质沉淀，而模型组小鼠的主动脉有大量斑块，左心室流出道管壁内增厚，且有脂质沉淀。与模型组比较，PNS给药后小鼠主动脉斑块面积有减少的趋势，对流出道损伤具有一定的改善作用。
PNS作为三七的主要有效成分，对多种心血管疾病均有良好的防治作用，且安全无明显毒副作用。近年来, 三七及其有效成分治疗AS的报道较多。本研究通过高脂ApoE-KO的AS小鼠模型系统评价了PNS对AS的治疗作用，并从降低血脂、保护血管内皮、缓解炎症反应、抑制免疫相关细胞的黏附等多个方面，对PNS抗AS机制进行了分析，提示PNS能从多个环节防治AS，值得进一步重视和开发为理想的抗AS药物。
( 致谢: 本研究在昆药集团研究院相应生物学及动物实验室完成，感谢黄茜、郑晓琼、尚建华等对实验给予的帮助！)
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