2. 湖北民族学院 科技学院医学系生物化学与分子生物学教研室,湖北 恩施 445000;
3. 湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北 恩施 445000;
4. 湖北民族学院 神经精神共患病研究所,湖北 恩施 445000
2. Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Medical Faculty, Science and Technology College of Hubei University for Nationalities;
3. Key Lab of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province;
4. Institute of Neurological and Psychiatric Comorbidity, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 445000, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是与年龄高度相关的神经退行性疾病,可导致脑萎缩、神经元与突触的丢失和大脑皮层神经递质的减少,最终导致老年人认知功能障碍和生活行为的困难。其主要病理改变为脑海马神经元周围的老年斑(amyloid-β protein, SP)、神经元内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)、长期炎症反应和神经元凋亡等[1]。主要发病机制包括淀粉样蛋白级联反应、Tau蛋白过度磷酸化、遗传因素、神经递质释放异常、细胞凋亡等学说。NFTs是AD的特征性病理特征,主要由过度磷酸化的Tau蛋白构成,在AD患者大脑皮层和海马中NFTs的数量多少及其分布与痴呆严重程度呈正相关[1-2]。而Tau蛋白是一种微管相关蛋白,主要分布于中枢神经元轴突中,与微管的稳定、物质的运输以及神经信息的传递密切相关[2]。
蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A, PP2A)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,广泛参与细胞信号传导、物质代谢、细胞增殖分化、细胞凋亡等反应。研究发现[2],PP2A其催化亚基PP2Ac能明显降低Tau蛋白的过度磷酸化,而AD患者脑内PP2Ac表达量及活性却较低。冈田酸(okadaic acid, OA)是一种海洋生物提取物,也是PP2A的特异性抑制剂,广泛应用于AD的实验研究[3-4]。体内和体外实验均证明,OA能特异性抑制PP2A活性[4-5],引起Tau蛋白多个位点的过度磷酸化,最终导致认知功能障碍[5]。
头顶一颗珠(Trillium Tschonoskii Maxim, TTM)为土家族道地药材,多在我国土家族民间使用,常用于眩晕、跌打损伤、神经衰弱的治疗[6-7]。其主要成分为甾体皂苷,现代医学研究发现该药具有抗肿瘤、消炎镇痛、免疫调节、改善心功能等功效[8]。有研究证明,TTM可通过增强大脑海马和皮质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性,减少丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量,通过抗氧化起到延缓衰老的作用[9]。TTM是否具有调节PP2A活性的作用目前尚不清楚,因此,有必要进行深入研究,并掌握其详细作用机制,促进该药开发利用。
1 材料与方法 1.1 药物与试剂按人(60 kg)为标准,TTM每人每千克用药的低、中、高剂量分别为0.083、0.167、0.333 g·kg-1,成人与大鼠的折算系数为6.25,大鼠(250 g)相当于人的临床等效低、中、高剂量分别为0.125、0.25、0.5 g·kg-1·d-1。TTM水煎液制备方法:称量100 g TTM并切碎,煎取2次、混匀、过滤,再浓缩定量至0.4 kg·L-1备用。OA购自美国Sigma公司; BCA蛋白浓度测定试剂盒,北京康为世纪生物科技有限公司; Tau-5抗体,美国Abcam公司; M-PP2Ac、DM-PP2Ac、PS307-PP2Ac,美国Cell Signaling Technology公司; pS396、pS404抗体,美国SAB公司; β-actin抗体,美国Proteintech公司。
1.2 仪器DMS-2型Morris水迷宫测试系统(中国医学科学院药物研究所); 099C K5424组织匀浆机(美国Glas-Col公司); 电泳槽、湿转槽、PowerPacTM基础电泳仪电源(美国伯乐公司); Odyssey双色红外荧光成像系统(美国LI-COR公司); VT1200S振荡切片机(德国徕卡公司); E200三目显微镜(日本尼康公司)。
1.3 实验动物与分组♂SD大鼠110只,体质量(250±30)g,购自湖北省实验动物研究中心,合格证号:42000600017418。大鼠适应性饲养2周后,随机分为10组:DMSO 1周组、OA 1周组、TTM灌胃1周低、中、高剂量组、DMSO 2周组、OA 2周组、TTM灌胃2周低、中、高剂量组,每组10只。另选10只SD大鼠备用。
1.4 造模和水迷宫训练给药1周组、给药2周组分别给予TTM灌胃1周、2周; OA 1周、OA 2周组、DMSO 1周、DMSO 2周组分别用饮用水灌胃。用药1周组在灌胃d 2同时进行水迷宫训练(水迷宫训练方法参照文献[10]),在灌胃d 7行海马注射OA,测试前24 h,OA组和治疗组双侧海马注射OA各1.5 μL(浓度均为0.392 mmol·L-1),DMSO组同样位置各注射10% DMSO 1.5 μL。用药2周组在灌胃d 9开始水迷宫训练,训练和测试方法同用药1周组。
1.5 海马匀浆蛋白Western blot分析实验方法参照本课题组前期实验[10]。一抗(p-Tau-Ser 396、p-Tau-Ser 404、Tau 5、M-PP2Ac、DM-PP2Ac、PS307-PP2Ac等); 荧光二抗(IRDye 800CW羊抗小鼠IgG、IRDye 800CW羊抗兔IgG)。Odyssey系统扫描成像,Image J计算灰度值。
1.6 脑片尼氏染色用显微镜挑选大小合适、无破损的海马脑片,用PBS清洗后,置于载玻片上,滴加适量的尼氏染色液,室温孵育20 min,脱水、透明后封片观察。
1.7 统计学方法本实验使用SPSS 22.0软件,按照单因素方差(One-way ANOVA)进行数据分析,结果以x±s表示。
2 结果 2.1 TTM对AD模型大鼠空间认知功能的影响Fig 1的水迷宫实验结果显示,注射OA后的大鼠逃避潜伏期明显长于注射前,OA组大鼠逃避潜伏期明显长于DMSO组,且游泳轨迹穿越第3象限平台的目的性弱,总的游泳路程长,用时长,说明AD模型大鼠空间学习记忆有障碍。预先给予TTM低、中、高剂量组逃避潜伏期均明显短于OA组,用药2周者具有剂量依赖性,且游泳轨迹穿越第3象限平台的目的性强,总的游泳路程短,用时少。上述结果提示,TTM低、中、高剂量均能有效改善OA大鼠空间学习记忆障碍。
2.2 TTM对AD模型大鼠脑海马PP2A活性的影响Fig 2的Western blot结果显示,与DMSO组比较,OA组甲基化水平明显下降,去甲基化水平明显上升,PP2Ac Y307磷酸化水平上升,表明PP2Ac活性降低。与OA组比较,TTM中、高剂量组甲基化水平升高,去甲基化水平和PP2Ac在Y307位点上磷酸化水平明显降低,表明PP2Ac活性升高。结果表明,中、高剂量的TTM能提高PP2A活性,特别是高剂量组效果更为明显,并具剂量依赖性。
2.3 TTM对AD模型大鼠脑海马Tau蛋白磷酸化的影响如Fig 3所示,OA组Tau蛋白pS396、pT404位点的磷酸化水平明显高于DMSO组,而TTM治疗1周高剂量组和治疗2周中、高剂量组的Tau蛋白pS396、pT404位点的磷酸化水平低于模型组,并呈剂量依赖性,说明高剂量TTM能有效降低Tau蛋白的磷酸化水平。
2.4 尼氏染色法结果如Fig 4所示,在海马CA1和CA3区,DMSO组尼氏小体数量明显多于OA组。TTM治疗组与OA组相比,治疗1周中、高剂量组CA1和CA3区尼氏小体数量多于OA组。TTM治疗2周高剂量组CA1区尼氏小体数量多于OA组,而在CA3区TTM低、中、高剂量组尼氏小体数量多于OA组,且高剂量组最为明显。提示TTM高剂量组能明显增加AD大鼠海马区尼氏小体的数量,修复损伤神经元。
3 讨论AD是与神经退行性病变相关的疾病,不仅导致认知功能下降,而且会引起心理或行为的一系列变化,导致一系列社会经济问题[11]。文献报道[1],AD患者脑组织中PP2A的表达和活性均明显下降,其与毒性淀粉样蛋白Aβ1-40, 42的增多呈负相关,而AD患者脑内特征性病理改变SP的主要成分即为神经元外的Aβ1-40, 42,该淀粉样蛋白可导致神经元损伤和凋亡,最终导致脑萎缩和认知功能障碍。PP2A的表达和活性下降还可导致Tau蛋白过度磷酸化,并形成AD的另一个特征性病理改变NFTs,也可导致认知功能障碍。大鼠脑海马内注射OA可有效抑制PP2A的活性,诱导记忆损伤,常伴有明显的神经病理变化,包括Tau蛋白的过度磷酸化和Aβ淀粉样斑块[12-13],可有效构建AD模型,并反映其认知功能障碍。因此,本课题通过大鼠脑海马区注射OA抑制PP2A活性,诱导构建AD模型,然后给予TTM处理,以观察该药是否能通过调控PP2A活性,进而逆转该模型大鼠的认知功能障碍。已有文献报道[7, 9],TTM作为土家族特色药材在抗AD方面有一定疗效和研究基础,其作用机制可能是通过升高AD大鼠脑组织的SOD、GSH-Px活性,从而抗氧化,降低MDA蓄积,最终达到延缓衰老作用。但TTM能否上调PP2A表达及活性,进而逆转Tau蛋白的过度磷酸化和Aβ 1-40, 42的表达,目前尚未见文献报道。为了观察TTM不同剂量和不同的给药时间对AD的影响,本实验TTM分为低、中、高3个剂量[14],在给药时间长度上分为1周、2周,以摸清不同剂量和不同时间点其药效如何。
水迷宫行为学实验测试结果显示,无论是用药1周还是2周,用药组大鼠穿过目的象限的次数增多,逃避潜伏期缩短,游泳轨迹穿越第3象限平台的目的性强,总的游泳路程短,用时少,呈一定的搜索策略,且与剂量具有一定依赖性。用药2周组整体水平略好于用药1周组。这一结果表明TTM可有效改善AD大鼠空间学习记忆能力,并具有剂量-时间依赖性。
Western blot结果发现,TTM用药1周和2周的中、高剂量组PP2A甲基化水平升高,而去甲基化水平和PP2Ac在Y307位点上的磷酸化水平明显降低,PP2A甲基化水平与其活性呈正相关,PP2Ac去甲基化水平和Y307位点的磷酸化水平与其活性呈负相关。该结果说明,两个时间点的TTM可有效提高OA抑制的AD大鼠脑海马PP2A活性。同时结果显示,两个时间点TTM的中、高剂量组中,Tau蛋白pS396、pT404两个位点的磷酸化水平低于OA组,特别是2周时间点更明显,而低剂量与OA组差异不明显,表明TTM能有效降低AD模型大鼠脑海马Tau蛋白磷酸化水平,并呈剂量依赖性。
尼氏体可反映神经细胞的功能活性[15],当神经元受损时,尼氏小体将会溶解,直至完全消失,但该病变具有可逆性。因此,有必要检测尼氏体以掌握TTM能否修复或改善受损神经元的功能活性。本实验用尼氏染色法检测海马区尼氏体的数量和分布情况,结果表明用药1周组,在海马CA1和CA3区,TTM中、高剂量组尼氏小体数量多于OA组,而在2周组中海马CA1区,TTM高剂量组尼氏小体数量明显多于OA组,在CA3区,低、中、高剂量组均明显多于OA组。此结果提示,TTM中、高剂量组在不同时间点均能明显增加AD大鼠海马区尼氏小体的数量,修复受损神经。
上述实验结果表明,TTM能有效提高OA抑制的AD大鼠脑海马PP2A活性,降低其诱导的Tau蛋白过度磷酸化水平,增加海马区尼氏小体的数量,从而改善AD大鼠空间记忆能力,并呈现一定的剂量依赖性,且与用药时间具有一定相关性。而TTM是否与用药时间呈更广范围的依赖性还有待于进一步的研究和探讨。
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