肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]，对于HCC的治疗，目前仍首选手术，但分子靶向治疗逐渐成为热点。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种核转录因子，在细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种自身免疫疾病的调节中起至关重要的作用，文献报道其在肝癌发生、发展中也起重要作用[2-4]。Caspase募集域和膜相关鸟苷酸激酶样结构域蛋白3(CARD recruited membrane associated protein 3，CARMA3)蛋白是NF-κB上游调节因子[5-7]。七叶皂苷钠(sodium aescinate, SA)是一种天然植物提取物，于2006年2月被中国食品药品监督管理局(CFDA)批准为临床用药，主要用于抗氧化、抗炎和保护血管损伤，相关研究证实七叶皂苷钠能防止炎症引起的肝损伤[8]。且NF-κB信号通路与氧化和炎症相关[9]，所以我们假设，通过干扰CARMA3/NF-κB信号通路，七叶皂苷钠可能有效抑制HCC的增殖。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 患者和标本本研究已获得安徽医科大学第一及第二附属医院伦理委员会批准。从我们的HCC组织库中选取2000~2015年期间100例HCC患者的原发性肝癌肿瘤组织和相邻肝组织。术前抗肿瘤治疗或由CT、MRI或PET证实肝外转移的患者被排除在本研究之外。所有患者均接受R0肝切除术。通过Edmondson分级系统表征分化和肿瘤分级。年龄、性别、肝硬化、肿瘤直径、微血管浸润、肿瘤分化情况等见Tab 1。每3个月进行1次随访，血清AFP、肝功能检查、HBV-DNA和肝脏超声检查结果均记录在案。随访的最后期限为2017年6月30日。总生存时间是从首次手术到患者死亡日期或最后一次随访测量的。
| Clinical characteristic | All samples(n=100) | High expression | Low expression | P |
| Gender(Female/Male) | 0.882 | |||
| Female | 11 | 7 | 4 | |
| Male | 89 | 50 | 39 | |
| Age (years) | 0.435 | |||
| < 52 | 49 | 26 | 23 | |
| >52 | 51 | 31 | 20 | |
| AFP/μg·L-1 | 0.424 | |||
| Positive(>20 μg·L-1) | 63 | 34 | 29 | |
| Negative(< 20 μg·L-1) | 37 | 23 | 14 | |
| Cirrhosis | 0.640 | |||
| Yes | 72 | 40 | 32 | |
| No | 28 | 17 | 11 | |
| HBV | 0.657 | |||
| Yes | 65 | 36 | 29 | |
| No | 35 | 21 | 14 | |
| Child-Pugh | 0.986 | |||
| A | 94 | 54 | 40 | |
| B | 6 | 4 | 2 | |
| Microvascular invasion | 0.666 | |||
| Yes | 28 | 15 | 13 | |
| No | 72 | 42 | 30 | |
| TNM stage | 0.008 | |||
| Ⅰ | 35 | 15 | 20 | |
| Ⅱ | 28 | 20 | 18 | |
| Ⅲ~Ⅳ | 27 | 22 | 5 | |
| Differentiation | 0.004 | |||
| Poorly | 25 | 19 | 6 | |
| Moderately | 41 | 26 | 15 | |
| Well | 34 | 12 | 22 | |
| Tumor number | 0.120 | |||
| Single | 87 | 47 | 40 | |
| Multiple | 13 | 10 | 3 | |
| Tumor size | ||||
| < 5 cm | 40 | 16 | 24 | 0.005 |
| >5 cm | 60 | 41 | 19 | |
| NF-κB expression | ||||
| High | 50 | 44 | 6 | 0.000 |
| Low | 50 | 13 | 37 |
七叶皂苷钠(中国武汉化工生物化学股份有限公司, 纯度98%); 超敏二步法免疫组化检测试剂盒(pv9001, 北京中杉金桥公司); 兔抗CARMA3多克隆抗体(ab36839，美国Abcam公司); 兔抗NF-κB(p65)单克隆抗体(D14E12，美国CST公司); 鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司); ECL发光试剂盒(美国Pierce公司); 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (美国Gibco公司); Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号:556547, 美国BD公司); BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司)。
1.1.3 仪器KHB(ST-360)酶标仪(中国上海)，CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。
1.2 方法 1.2.1 组织微阵列免疫组化手术切除的肿瘤标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。组织微阵列(TMA)由Ai-We-Er公司(中国武汉)制造。每个TMA排列25对组织，切片4 μm厚，2 mm大小。使用超敏二步法进行免疫组化染色。将切片在二甲苯中脱石蜡，用梯度无水乙醇脱水，然后在0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中，在压力锅中煮沸3 min。用0.3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物活性，并将切片与正常山羊血清溶液在室温下孵育1 h以减少非特异性结合。将一抗(CARMA3 1 :50稀释，NF-κB 1 :200稀释)在4℃孵育过夜。次日二抗在室温下孵育1 h。
1.2.2 细胞系和细胞培养人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和正常肝细胞系HL-02均获自中国科学院细胞库(www.cellbank.org.cn)。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、5% CO2的培养箱中，每3 d更新培养基。
1.2.3 MTT检测取对数生长期的细胞，以3×103个/孔的密度接种到96孔培养板中，以10、20、30、40 μmol·L-1的七叶皂苷钠分别处理24、48、72 h。对照组与治疗组给予相同量的溶剂(DMSO)。然后，向每个孔中加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，将细胞在37℃下孵育4 h。加入150 μL DMSO，以溶解所得的晶体。使用酶标仪在570 nm处检测OD值。使用以下公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率/%=(1-OD实验组/ OD对照组)×100%。
1.2.4 细胞凋亡检测使用Annexin V/PI法检测细胞凋亡率。将细胞接种于6孔板，贴壁后用七叶皂苷钠处理48 h，胰蛋白酶消化，预冷PBS洗涤2次后，用100 μL缓冲液(1×108·L-1)重悬后，转移到5 mL培养管中，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，避光反应15 min，最后加入400 μL缓冲液至管中，通过流式细胞仪检测。
1.2.5 Western blot将细胞在RIPA裂解液中冰浴裂解30 min，4℃、15 000 r·min-1离心20 min。将上清液保存在-80℃。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加载到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到PVDF膜。5% BSA室温下封闭1 h，抗体CARMA3(1 :100)和NF-κB(1 :1 000)在4℃孵育过夜。与二抗(1 :10 000)在室温下孵育1 h。ECL试剂盒显色，Image J图像处理系统分析Western blot灰度值。
1.2.6 统计学分析采用SPSS 17.0版软件进行分析，临床基线资料和蛋白表达量相关数据采用χ2检验及Fisher确切概率法。Kaplan-Meier检验用于生存数据分析，log-rank cox用于差异性检验。
2 结果 2.1 CARMA3在人肝癌组织中过表达且与临床病理、肿瘤直径、TNM分期及预后相关患者基本特征见Tab 1。TMA免疫组织化学染色结果显示(Fig 1)，CARMA3主要位于肿瘤细胞的细胞质中，与57例(57%)HCC患者相比，相同患者的相邻肝组织相对较高。CARMA3在低分化和TNM恶性分期高的组织中的表达明显高于相应的正常组织(P=0.004，P=0.008)。在肿瘤直径大于5 cm的亚组中，肿瘤组织中CARMA3的表达差异有统计学意义(P=0.014)。然而，性别、年龄、HBV、AFP水平、Child-Pugh、肝硬化、肿瘤数目和微血管浸润亚组CARMA3表达差异无统计学意义(Tab 1)。在100例患者中，93例患者完全随访记录，分为高表达组和低表达组两组。Kaplan-Meier曲线表明，CARMA3或NF-κB过表达患者总体生存期、总体存活率低于CARMA3或NF-κB低表达者(Fig 1B)。结果表明，CARMA3和NF-κB的过表达与总生存期明显相关(P=0.027，P=0.005)，且CARMA3的表达程度明显与NF-κB表达程度相关(P < 0.01)。
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| Fig 1 Expression of CARMA3/NF-κB in hepatocellular carcinoma and adjacent paracancerous tissues and its correlation with prognosis A:Expression of CARMA3 and NF-κB in HCC tissues was higher than that in paracancerous tissues; B:The patients with low CARMA3 and NF-κB expression had long overall survival time. |
七叶皂苷钠处理72 h后能明显抑制HepG2和Hep3B细胞株的增殖(IC50=46 μmol·L-1)。然而，七叶皂苷钠对HL-02细胞系的增殖几乎无影响。此外，七叶皂苷钠的抑制作用呈时间和剂量依赖性(Fig 2)。Fig 3流式实验结果表明，七叶皂苷钠能够有效促进HepG2和Hep3B细胞系的凋亡。
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| Fig 2 Effect of sodium aescinate on HCC cell lines and normal liver cell HL-02 A: Effect of sodium aescinate on three cell lines for 48 h; B: Effect on HepG2 of sodium aescinate was stronger with the concentration increase and time-dependent; C: Effect on Hep3B of sodium aescinate was stronger in a concentration-and time-dependent manner.**P < 0.01 vs 24 h |
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| Fig 3 Apoptosis of three cell lines at a concentration of 40μmol·L-1 A:The number of early apoptosis of SA-treated tumor cells was higher than that of the control group and not obvious in normal cells from the flow cytometry; B: The early apoptotic rate of SA-treated tumor cells was significantly higher than that of the control group, but no effect was detected on normal liver cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
40 μmol·L-1七叶皂苷钠处理肝癌细胞48 h后，Fig 4A免疫荧光实验发现，CARMA3的表达主要位于细胞质中，而NF-κB主要在细胞核中表达，和免疫组化结果一致，且七叶皂苷钠抑制HCC细胞中CARMA3和NF-κB的表达。Fig 4B Western blot结果进一步证实七叶皂苷钠可下调CARMA3和NF-κB表达(P < 0.05)。
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| Fig 4 CARMA3, NF-κB expression and gray value A: Immunofluorescence was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB in cells; B: Western blot was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB; C: CARMA3 and NF-κB gray value ratio. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
七叶皂苷钠是一种天然植物提取物，因其在抗炎、抗氧化方面取得良好疗效，被批准用于临床，但其抗肿瘤作用研究报道较少。齐世美等[10]报道，七叶皂苷钠能通过抑制Akt、ERK上游信号Src活性，诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，但其在抗肝癌中的作用尚未见相关报道。CARMA3蛋白与多种肿瘤的发生、发展相关，如肾癌、结肠癌、肺癌[11-14]，但在肝癌中的报道很少。在本研究中，我们使用TMA分析评估了HCC患者组织中CARMA3的表达及其临床相关性。体外研究结果表明，七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路，抑制肝癌细胞系的增殖并促进其凋亡，但对正常肝细胞无影响。
CARMA3在肝癌组织中的TMA染色结果显示，在低分化的HCC组织或肿瘤直径大于5 cm的肿瘤中CARMA3的表达较高，且表达程度与患者的总生存期呈正相关，CARMA3表达程度低的患者倾向更长的术后生存时间。本研究结果表明，CARMA3的表达程度与HCC组织中NF-κB的表达明显相关，更进一步证明CARMA3是NF-κB的上游调节因子，揭示CARMA3/NF-κB信号通路在肝癌患者中处于激活状态。体外研究发现，七叶皂苷钠抑制HCC细胞株的增殖并诱导其早期凋亡，细胞免疫荧光和Western blot实验证实，七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路发挥其抗肿瘤作用。更重要的是，我们发现，七叶皂苷钠在相同浓度下，对正常肝细胞几乎没有细胞毒性作用。众所周知，HCC的化学疗法不尽人意，且对于治疗HCC的药物总是在Ⅲ期试验中失败; 虽然索拉非尼被批准为HCC的一线分子靶向药物; 然而索拉菲尼由于成本高，对患者有副作用，很难普及，且索拉非尼的耐药性也是一个挑战。因此，迫切需要找到一种有效和经济的药物。本研究结果显示，七叶皂苷钠满足这些条件，在治疗HCC中具有潜在的临床应用价值。总之，本研究发现CARMA3在肝癌组织中过表达，与HCC患者的预后相关，且七叶皂苷钠通过抑制CARMA3/NF-κB信号通路，能有效抑制人肝癌细胞的增殖。
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