2. 上海医药工业研究院创新药物与 制药工艺国家重点实验室，上海 200437;
3. 上海市生物物质成药性评价专业技术服务平台，上海 200437
2. State Key Lab of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200437, China;
3. Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation, Shanghai 200437, China
呼吸道病毒和细菌感染诱发的炎症能够使呼吸道疾病恶化，如哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺部囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)[1]，疾病恶化会导致死亡率升高。然而，目前缺乏有效的方法能阻止呼吸道疾病的发生和恶化。为了明确疾病的发病机制，发展并验证新的治疗方法，许多研究者致力于建立能够准确模拟临床人类呼吸道疾病特征的小鼠模型。通过对已发表的国内外文献的调研，本文对感染加重以上3种常见呼吸道疾病的小鼠模型的研究现状进行总结论述，以促进此类模型的正确运用以及治疗药物的研发。
1 感染加重哮喘的小鼠模型呼吸道病毒和细菌感染与哮喘的发生及恶化息息相关[1]，迄今为止，已有大量关于小鼠呼吸道感染加重哮喘的研究。本部分内容根据小鼠感染年龄的不同，将此类研究分为两种，分别是生命早期感染和成年期感染。
1.1 生命早期感染加重小鼠的哮喘模型早期的研究表明，新生儿和初生小鼠的Ⅱ型T辅助细胞(T helper cell 2，Th2)的免疫调节活性远低于成年期，所以许多研究者开始应用初生的小鼠模型研究感染加重哮喘的机制[2]。
已知呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染能够诱导儿童支气管哮喘的发生和发展[3]。Siegle等[4]在小鼠初生即感染鼠肺炎病毒(与RSV同种属)，感染恢复后，滴鼻给予卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏，再使其长期吸入雾化OVA，发现小鼠成功发展为慢性哮喘，并导致Th2相关的细胞因子包括白介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-5、IL-13表达增多。
鼻病毒(rhinovirus，RV)感染是婴幼儿哮喘发病的高危因素。Han等[5]发现，RV感染能够诱导小鼠的肺部黏液化生和气道高敏(airway hyperreactivity，AHR)，2型先天性淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2s)的数目以及IL-13、IL-25的表达增加，并且缺乏正常的γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)反应[6]。进一步的研究发现，通过恢复小鼠的IFN-γ反应，能抑制表达IL-13的ILC2s的扩增，从而抑制哮喘的发展，说明IFN-γ可能是治疗哮喘的靶标[6]。Han等[5]应用Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)基因敲除小鼠发现，TLR2+巨噬细胞是RV诱导感染的必要因素。
此外，研究者发现，生命早期的肺炎衣原体感染能够诱导Th2免疫反应，以及肺部结构和功能的永久性改变[2]。Starkey等[7]使肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因敲除的小鼠感染肺炎衣原体，发现TRAIL与生命早期衣原体感染的严重程度相关。此外，Starkey等[8]发现，在敲除IL-13基因的小鼠体内，感染诱导的持续AHR消失，应用抗IL-13的单克隆抗体可以防止严重过敏性气道病的发生。由此推断，通过靶向TRAIL和IL-13，可能对生命早期衣原体感染诱导的严重哮喘有治疗作用。
总之，以上研究表明，生命早期的呼吸道感染可能对肺部结构和免疫反应产生永久性的改变作用。
1.2 成年期感染加重小鼠的哮喘模型感染使哮喘恶化的成年病人也会表现出AHR和Th2细胞反应增强等病理特征。然而，成人的呼吸道感染更多会诱导抵抗类固醇治疗的中性粒细胞炎症[1]。目前，研究者也建立了此类哮喘小鼠模型来进一步探究感染与哮喘的关系。
大量的临床数据表明，呼吸道衣原体感染与严重的抵抗类固醇治疗的哮喘相关[9]。Horvat等[10]使小鼠在经OVA敏化和激发前7 d感染衣原体，发现衣原体感染能使OVA诱导的Th2反应和嗜酸性粒细胞炎症减轻，但会使Th1和Th17反应以及中性粒细胞炎症增加。Kim等[9]发现，中性粒细胞的数量与炎症小体3(inflammasome 3，NLRP3)和IL-1β mRNA的表达呈正比。通过给予模型小鼠IL-1β的中和抗体能够使IL-1β的表达水平降低，气道炎症和AHR减轻，说明靶向肺部增高的IL-1β可能是难治性哮喘的有效治疗靶标[9]。Essilfie等[11]应用流感嗜血杆菌，也得出Horvat等类似的结果，此外还发现中性粒细胞的炎症增加与IL-17的表达增加相关，通过应用抗IL-17的单克隆抗体能消除感染诱导的中性粒细胞炎症。
Chen等[12]应用RSV感染加重哮喘的小鼠模型证实，溴结构域(bromodomain and extra-terminal, BET)蛋白抑制剂能明显抑制AHR，减少巨噬细胞和中性粒细胞的数量以及细胞因子的表达水平，说明BET蛋白可以作为治疗抵抗类固醇的炎症性哮喘的潜在靶标。
总之，细菌或病毒进入体内后会首先利用Th2细胞免疫应答的不足来加重哮喘症状，然后通过诱导Th1和(或)Th17免疫反应，造成抵抗类固醇治疗的严重哮喘[1]。
2 感染加重COPD的小鼠模型COPD是一种由有害气体或颗粒引起的，以慢性阻塞性细支气管炎、肺气肿和黏液堵塞为病理特点的，慢性进行加重的呼吸系统疾病。COPD病人病情的恶化通常是由并发症的发展或呼吸道细菌或病毒感染所致[16]。本部分内容根据COPD模型小鼠建立的不同，将研究者对于感染加重COPD小鼠模型的研究分为两类。
2.1 感染加重吸烟诱导的COPD小鼠模型由于吸烟是人类COPD的主要诱因，所以吸烟诱导COPD的小鼠模型能够准确模拟人类COPD的发生[13]。流行病学研究显示，大约一半的COPD病人的病情恶化是由病毒感染引起的，常见的有流感病毒、RSV、RV[14]。研究者使BALB/c小鼠暴露于烟雾4 d(短期)后感染流感病毒，发现与单纯吸烟或病毒感染的小鼠相比，经双重刺激小鼠的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的巨噬细胞、中性粒细胞、病毒特异性CD8+T淋巴细胞数目增多[13]。研究者使C57BL/6小鼠吸烟3~5个月(长期)后也发现，流感病毒感染能够加重炎症反应，具体表现出气道中TNF-α、IL-6、IFN表达的增加，以及死亡率的升高[14]。
由于应用活性病毒的实验需要采取防护措施，且实际操作困难，研究者应用聚肌胞苷酸[poly(I:C)]模拟病毒感染，成功建立了COPD恶化的小鼠模型，并发现香烟暴露与poly(I:C)共刺激能够加速肺气肿和气道纤维化的进程，增加中性粒细胞的数量，增强AHR[13]。
呼吸道细菌感染也是COPD恶化的诱因，Richmond等[15]使能自发发展为COPD表型的多聚免疫球蛋白基因敲除的小鼠吸烟6周后，感染流感嗜血杆菌，发现小鼠的小气道壁重塑程度和肺气肿症状加重，巨噬细胞和中性粒细胞数目增多。Pichavant等[16]使小鼠吸烟12周后感染肺炎链球菌，发现小鼠体内的IL-17和IL-22的表达增加。以上研究表明，细菌感染和香烟暴露对COPD恶化有协同促进作用。
结合临床研究的结果分析，以上小鼠模型能够模拟感染使COPD恶化的病理特征，可以被用于进一步探索疾病机制和开发新的治疗方法。
2.2 感染加重弹性蛋白酶诱导的COPD小鼠模型虽然吸烟诱导的COPD小鼠模型能够模拟人类COPD的发病特征，但即使长期烟雾暴露也很难造成严重的COPD。考虑到人体内弹性蛋白酶的失调能够诱导COPD，研究者开始应用其作为COPD模型小鼠的诱因[17]。Ganesan等[18]给小鼠灌注4周弹性蛋白酶和LPS，诱导COPD样肺部炎症和肺气肿，然后使小鼠感染流感嗜血杆菌，发现小鼠体内的细菌清除能力下降，中性粒细胞炎症增加，黏液分泌时间延长，与巨噬细胞吞噬作用相关的清道夫受体A表达减少[18]。研究显示，清道夫受体A在小鼠体内的细菌清除能力中发挥重要作用，其基因突变也会增加人类COPD的发病风险。然而，Singanayagam等[17]表示，多次接触弹性蛋白酶和LPS后感染RV的模型小鼠，不能模拟临床RV感染加重COPD的病征。相反，通过单次给予弹性蛋白酶后滴鼻感染RV的方式，可以使气道中的中性粒细胞炎症升高，包括TNF-α、CXCL10、CCL5、CXCL2表达增加，黏液分泌增加和AHR。此外，研究者分析了可能造成第1种造模方式失败的原因，一是长期LPS暴露会减少中性粒细胞数量，以及RV诱导的中性粒细胞趋化因子的表达；二是大量的弹性蛋白酶会导致严重的肺损伤，从而会阻碍之后的炎症反应[17]。
总之，以上研究表明，感染加重弹性蛋白酶诱导的COPD小鼠模型，可以模拟临床COPD恶化的病理特征。然而，关于弹性蛋白酶的应用方法还存在争议，今后需要进一步研究验证，从而促进这种建模方式的应用。
3 感染加重肺部CF的小鼠模型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)感染在肺部CF病人中最为常见，长期的呼吸道PA感染也是肺部CF病变最严重的风险因素[19]。所以，本部分内容主要总结目前关于PA感染使两种小鼠模型(野生型和基因改造型)肺部CF恶化的研究进展。
3.1 PA感染加重基因改造小鼠的肺部CFCF是一种因囊性纤维化跨膜受体(CF transmembrane regulator，CFTR)失调而诱发的复杂的多器官疾病，其中肺部CF是CF研究的热点[20]。早在1992年，先天患有CF的CFTR基因敲除(Cftr-/-)小鼠建立, 并被广泛应用于疾病机制的探索[20]。Wu等[20]给Cftr-/-小鼠鼻内滴注PA的LPS，发现小鼠的气道狭窄加剧，BALF中的花生四烯酸和前列腺素增多，随之证实，能促进花生四烯酸产生的胞质型磷脂酶A2α(cytosolic phospholipase A2α，cPLA2α)在气道狭窄的诱导中发挥重要作用，可以被用作肺部CF的治疗靶标。Paroni等[21]也发现，耐药性PA菌株感染使Cftrtm1UNC小鼠的白细胞数量增多，细胞因子和趋化因子的表达水平增加，此外还发现，穿透素3能够使CF小鼠肺部的IL-17和CCL2/MCP-1表达水平明显降低，显示出良好的治疗效果。
除了关注CFTR，Antje等[22]也探究了小鼠基因型对CF的影响，发现Cftrtm1Unc-Tg(FABPCFTR)1Jaw/J小鼠与其同源野生型小鼠被PA感染的影响程度较低，然而CftrTgH(neoim)Hgu小鼠与其同源野生型小鼠表现出严重的感染症状，说明在PA感染诱导CF的发展中，基因背景可能比CFTR失调更为重要。然而，Emanuela等[23]的研究指出，虽然野生型小鼠和Cftr-/-小鼠在长期接触PA的LPS后，都表现出肺部损伤，但野生型小鼠很快恢复正常，Cftr-/-小鼠却转变为长期慢性炎症, 说明Cftr-/-小鼠在此类模型的应用中显现出明显优势。
3.2 PA感染诱导野生型小鼠产生严重肺部CF在应用野生型小鼠时，研究者关注的是，通过PA菌株和小鼠基因型的选择以及造模方式的改进，使PA在小鼠肺部定植时间延长，建立慢性严重性肺部CF小鼠模型。在PA的应用中比较明确的是，给小鼠气管或鼻内移植固定介质(如琼脂、琼脂糖、海藻藻酸盐等)包裹的PA菌株能延长细菌在小鼠体内的定植时间[19]。黏液型PA比同源非黏液型菌株在小鼠肺中的存活率更高。此外，接种菌株的数目也会影响造模效果[19]。
不同的小鼠品系具有不同的疾病易感性，如C57BL/6NCrlBR小鼠易感急性中性粒细胞炎症为主的广泛组织损伤。然而，组织损伤较轻或无的慢性肉芽肿样炎症在BALB/c中更为常见。此外，小鼠品系之间微小的基因型差异也会影响慢性PA的易感性[19]。
Facchini等[24]成功地使PA的临床株RP73在C57Bl/6NCr小鼠的气管内存在了3个月以上，而且小鼠的肺部病变与晚期肺部CF患者相似。Bayes等[25]给C57BL/6小鼠气管内接种PA的临床黏液株NH57388A，小鼠表现出急性死亡率降低、体质量降低、中性粒细胞增多、抗生素治疗无效等人类CF特征。两个研究都指出，发展为慢性PA感染的小鼠是支气管或部分肺叶的感染，而不是整个肺实质的感染，说明部分肺部感染可能是实现慢性感染的关键[24-25]。
4 结语小鼠模型是帮助研究气道炎症诱发疾病和疾病恶化进程的有效工具，通过控制感染的时间和水平以及其他条件，模型小鼠能够比较准确地反映感染对慢性呼吸道疾病的影响，帮助阐明疾病的机制，识别疾病治疗的新靶点，此外，还可用于新方法疗效的验证[1]。
通过小鼠模型的应用，研究者已经发现，生命早期的病毒和细菌感染会改变肺部结构和免疫应答，加重哮喘[5]。在接下来的生命进程中，免疫表型会被进一步改变，发展为抵抗类固醇治疗的严重疾病症状[11]。吸烟或弹性蛋白酶诱发COPD小鼠的呼吸道感染会使气道和肺泡的炎症和重塑水平进一步增加[13, 17]。PA感染能够加重肺部CF小鼠的疾病症状，同时CF小鼠更易遭受PA感染。然而，还有很多机制未明的临床案例有待建立相应的小鼠模型，例如生命早期感染结合成年期吸烟加重哮喘，以及生命早期病毒和细菌共感染诱发哮喘。目前，有研究建立了病毒诱导二次感染细菌的COPD小鼠模型，应用不同的病原感染时间和细菌病毒组合建立的模型，表现出相似的病毒细菌共感染的机制，例如病毒感染恢复期间产生的干扰素会损害机体的细菌防御屏障等[14]，但是这种小鼠模型还有待完善。
值得注意的是，考虑到实验操作中存在的安全风险因素，通过动物模型得到的实验结果是不可能在临床人体上验证的，所以，在解释小鼠模型表现出的结果以及将结果转换到人类研究时，必须注意确保疾病特征的一致性[14]。由于人类和小鼠之间存在种属差异，而且几乎不可能在生命周期过短的小鼠身上复制人类经过多年的多重感染才引发的疾病的特征，所以动物模型几乎不可能精确模拟人类疾病[23]。但是，在充分了解疾病基础上发展临床前动物模型，将会对人类疾病的研究提供极大帮助。
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