2. 潍坊医学院 医学研究实验中心，山东 潍坊 261053;
3. 潍坊医学院 护理学院，山东 潍坊 261053
2. Dept of Pathology, College of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China;
3. College of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China
最近研究表明，microRNAs在恶性肿瘤的侵袭与转移中所起的作用是一个复杂的过程[1]，在此过程中涉及多种通路，如JAK/STAT、PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/MMP途径，其中PI3K/Akt通路与多种肿瘤的侵袭与转移有关，如胰腺癌[2]、肝癌[3]等。先前研究表明，miR-125a-5p靶向调控GRB相关蛋白2(GRB-associated binding protein 2，GAB2)影响乳腺癌的迁移能力[4]，并且也证明GAB2通过PI3K/Akt/MMP通路，促进乳腺癌的侵袭与转移[5]，但是关于miR-125a-5p是否通过PI3K/Akt/MMP途径抑制乳腺的侵袭与转移，目前尚未有研究。本实验主要通过改变miR-125a-5p和GAB2在乳腺癌细胞中的表达水平，探讨miR-125a-5p抑制乳腺癌侵袭与转移的机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病例资料收集潍坊医学院附属医院2012-2017年的乳腺癌组织及其癌旁相对正常组织(＞5 cm)各85例作为研究对象。这些病理组织已经确诊为乳腺浸润性导管癌，根据WHO标准进行分级，患者均为女性，术前未经过任何化疗和放疗，年龄30~70岁，临床资料完整。所有85例乳腺癌患者均签署知情同意书。
1.1.2 试剂与细胞株基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、β-actin抗体，均购自Cell Signaling Technology公司；质粒均由吉凯基因构建合成；逆转录试剂盒Prime Script RT Reagent Kit、PCR试剂盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit，均购自TaRaKa公司；Transwell小室购自Corning公司；Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MDA-MB-231(MDA231)、MCF-7购自ATCC。
1.1.3 仪器二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)，双垂直电泳槽(Bio-Rad公司)，Bio-Tek酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与转染参照文献[6]操作，按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，质粒浓度0.761 9 g·L-1，转染48 h，分组如下：① MDA231/NC(negative control)组：转入过表达对照质粒；② MDA231/miR-125a-5p组：转入miR-125a-5p过表达质粒；③ MDA231/Con+miR-125a-5p组：共转染GAB2过表达对照质粒和miR-125a-5p过表达质粒；④ MDA231/GAB2+miR-125a-5p：共转染GAB2过表达质粒和miR-125a-5p过表达质粒。
1.2.2 Western blot实验各组转染后细胞加入裂解液，提取蛋白。进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，分别孵育一抗、二抗。所用抗体浓度：β-actin(1：1 000)，MMP-2、MMP-9、p-Akt、Akt(1：500)。所得的条带用ImageJ进行灰度值扫描。
1.2.3 荧光定量PCR检测提取MCF-10A、MDA231、MCF-7细胞以及85例组织的RNA，进行逆转录，进一步进行qRT-PCR。miR-125a-5p的上游引物：5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′, 以U6作为内参，茎环结构: GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG。进行qRT-PCR，反应条件为：95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35个循环。共有85例病理组织，将所得的结果分为miR-125a-5p高表达组(高于中位数)和miR-125a-5p低表达组(低于中位数)。
1.2.4 Transwell侵袭实验转染后48 h，处理细胞，取3.5×104个细胞滴入上室，下室加入500 μL胎牛血清，继续培养24 h，多聚甲醛固定20 min，Giemsa染色40 min，实验重复3次。随机取5个视野进行拍照、计数，计算平均值，实验独立重复3次。
1.2.5 统计学方法应用SPSS 22.0软件对实验结果进行分析，计量资料采用独立样本t检验，计数资料之间的比较采用χ2检验，多组比较使用单因素方差分析。
2 结果 2.1 miR-125a-5p在乳腺癌组织中的表达及与临床病理参数的关系应用qRT-PCR检测85例病理组织中miR-125a-5p的表达量。Tab 1结果显示，miR-125a-5p低表达者为51例(低于中位数)，高表达者34例(高于中位数)。其中，miR-125a-5p的表达水平与淋巴结的转移、雌激素受体(ER)和组织学分期有关(P＜0.05)，而与其他病理参数，如年龄、肿瘤大小、孕激素受体(PR)无关。
| Clinicalparameters | n | miR-125a-5p expression | χ2 | P value | |
| Low | High | ||||
| Age/years | |||||
| ≤50 | 55 | 35 | 20 | 0.859 | 0.354 |
| ＞50 | 30 | 16 | 14 | ||
| Tumor size | |||||
| ≤2 cm | 28 | 19 | 9 | 1.074 | 0.300 |
| ＞2 cm | 57 | 32 | 25 | ||
| Lymph node metastasis | |||||
| No | 58 | 28 | 30 | 10.458 | 0.001 |
| Yes | 27 | 23 | 4 | ||
| ER | |||||
| + | 59 | 40 | 19 | 4.885 | 0.027 |
| - | 26 | 11 | 15 | ||
| PR | |||||
| + | 60 | 36 | 24 | 0.000 | 1.000 |
| - | 25 | 15 | 10 | ||
| Histological grade | |||||
| Ⅰ~Ⅱ | 45 | 20 | 25 | 9.641 | 0.002 |
| Ⅲ~Ⅳ | 40 | 31 | 9 | ||
| PR: Progesterone receptor; ER: Estrogen receptor. | |||||
应用qRT-PCR检测细胞中miR-125a-5p的表达水平。Fig 1结果显示，miR-125a-5p在MDA231和MCF-7细胞中表达水平比MCF-10A细胞明显降低(P＜0.05)。
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| Fig 1 Expression levels of miR-125a-5p in MCF-10, MCF-7 and MDA231 cells (x±s, n=3) *P < 0.05 vs MCF-10A |
Transwell侵袭实验检测miR-125a-5p对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。如Fig 2所示，与MDA231/NC细胞组相比，用EGF刺激后，MDA231/miR-125a-5p细胞组穿过基膜小孔的细胞数减少(P＜0.05)；与MDA231/Con+miR-125a-5p细胞组相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p细胞组穿过基膜小孔的细胞数增加(P＜0.05)。结果表明，miR-125a-5p抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。
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| Fig 2 miR-125a-5p inhibited invasion of breast cancer cells(x±s, n=3) Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1 EGF. A: Representative images of penetrated cells with EGF stimulation; B, C: Quantification analysis of Transwell invasion assay on cells. *P < 0.05 vs MDA231/NC or MDA231/Con+miR-125a-5p. |
Fig 3的Western blot结果显示，用EGF刺激后，与MDA231/NC细胞组相比，MDA231/miR-125a-5p细胞组p-Akt水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与MDA231/Con+miR-125a-5p细胞组相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p细胞组p-Akt水平明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| Fig 3 Expression of miR-125a-5p affected phosphorylation level of Akt through EGF stimulation (x±s, n=3) Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1 EGF. Expressions of Akt and p-Akt were detected by Western blot. *P < 0.05 vs MDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+). |
Fig 4的Western blot结果显示，用EGF刺激后，与MDA231/NC细胞组相比，MDA231/miR-125a-5p细胞组MMP-2和MMP-9的表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与MDA231/Con+miR-125a-5p细胞组相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p细胞组MMP-2和MMP-9表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明，miR-125a-5p下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达。
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| Fig 4 miR-125a-5p down-regulated expression of MMP-2 and MMP-9 protein(x±s, n=3) Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1 EGF. Expressions of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot. *P < 0.05 vs MDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+). |
乳腺癌是女性癌症死亡的首要原因，在其早期阶段通常没有致命性，但发生转移后，患者的死亡率将会升高[7]。因此，研究乳腺癌的侵袭与转移至关重要。miRNAs是一类长约18~25个的核苷酸序列，它通过与靶基因mRNA的3′非翻译区作用，发挥其功能[8]。近年来对于miR-125a-5p的研究更加深入，并且发现miR-125a-5p与多种疾病的发生相关。Zhu等[9]发现，miR-125a-5p能够作为评估非小细胞性肺癌疾病进展和预后的一种重要指标。Banerjee等[10]发现，miR-125a-5p参与炎症的发生，影响巨噬细胞的功能。本实验发现miR-125a-5p的表达与乳腺癌患者临床病理参数有关，荧光定量PCR检测发现miR-125a-5p在MDA231和MCF-7细胞的表达量明显下降，Transwell结果显示miR-125a-5p抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。
先前研究表明，miR-125a-5p可通过与其靶蛋白GAB2结合，从而抑制乳腺癌的侵袭与转移，而GAB2可与PI3K作用，进而活化Akt，且该信号通路广泛存在于细胞中。Tang等[11]发现，miR-125a-5p可通过PI3K/Akt/mTOR抑制肝癌细胞的侵袭与转移。本实验发现，miR-125a-5p能够通过调节PI3K/Akt通路的转导，抑制乳腺癌细胞的侵袭与转移。
许多研究表明miR-125a-5p在恶性肿瘤中低表达，如肝癌[12]、胃癌[13]等。先前的研究结果提示，miR-125a-5p在恶性肿瘤中主要发挥抑癌基因的作用。其中，GAB2作为miR-125a-5p的靶蛋白，GAB2与MMP-2和MMP-9的表达呈正相关，GAB2可调控MMP-2和MMP-9的表达[14]。本实验室前期研究发现，在胶质瘤中，上调miR-125a-5p的表达水平可引起MMP-2和MMP-9表达的下调[6]。本实验结果显示，MDA231/miR-125a-5p细胞组中MMP-2和MMP-9的表达量下降，而在MDA231/GAB2+miR-125a-5p细胞组中，MMP-2和MMP-9表达量明显升高。结果表明，miR-125a-5p下调MMP-2和MMP-9的表达。
综上所述，miR-125a-5p在乳腺癌中低表达，miR-125a-5p可通过PI3K/Akt信号通路下调MMP-2和MMP-9的表达，从而抑制乳腺癌的侵袭与转移。这将会加深对乳腺癌的研究。
( 致谢: 本实验是在潍坊医学院医学研究实验中心完成，非常感谢各位老师和同学的帮助。)
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