瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical，TRP)是一类重要的阳离子通道。辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是TRP家族通道蛋白之一，为热敏感蛋白，可被高于42℃的温度、炎症、疼痛、辣椒素等体内多种因素激活[1-2]，主要存在于中枢神经系统及末梢神经系统上。TRPV1目前在疼痛、炎症、中医寒热病证、中药寒热药性等方面有重要意义[3-4]。TRPV1蛋白后期的磷酸化对其功能的发挥至关重要，有研究表明，cAMP/PKA通路可促进TRPV1的磷酸化，使其激活[5-6]。另有研究发现，TRPV1活化后，促进cAMP含量升高[3]，两者之间的调控作用尚不明确。课题组前期研究表明，体内cAMP/PKA信号通路的磷酸化水平与TRPV1的蛋白表达有一定相关性[7]。因此，本研究通过体外细胞实验，分别应用两者的激动剂和抑制剂干预，进一步探讨TRPV1与cAMP/PKA信号通路之间的调控作用。
1 材料 1.1 实验动物新生大鼠购自第四军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(军)2012-0007。
1.2 试剂胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM/F12培养基购自Hyclone；TRIzol(货号15596-026)购自无锡菩禾；逆转录试剂盒(货号#K1622)购自Thermo公司；cAMP/PKA信号通路激动剂8-Br-cAMP(货号ab141449)、抑制剂H-89(货号ab143787)、TRPV1激动剂辣椒素capsaicin(货号ab140100)、抑制剂i RTX(货号ab146031)，均购自Abcam公司。
1.3 仪器Thermo Scientific 8000细胞培养箱(美国赛默飞世尔公司)；XDS-1A光学显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；DMI3000B倒置拍照显微镜、TCS SP5 Ⅱ共聚焦显微镜(德国Leica公司)；ABI-7500 Real-time检测仪(ABI公司)；Mini protean 3 cell电泳仪(美国Bio-Rad公司)；ChemiScope一体式化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司)。
2 方法 2.1 大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)细胞的分离与鉴定参考文献[8]，新生大鼠注射15%水合氯醛处死，放入低温的DMEM不完全培养液，大鼠死后，快速分离脊髓，摘取DRG并剪碎，放入含胶原酶的DMEM/F12培养基中60~90 min。再置于含0.125%胰蛋白酶的磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline，PBS)溶液中15 min。用含10% FBS的DMEM/F12培养基终止消化，获取的细胞接种于神经细胞完全培养基中，d 2换液继续培养。细胞传代24 h，4%多聚甲醛固定，加入神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，室温封闭15 min。加入对应二抗，37℃孵育1 h，洗涤，Hoechst 33258染液，室温避光孵育30 min。细胞于荧光显微镜下观察，随机计数10个视野中细胞总数和β-tubulin Ⅲ的染色阳性细胞数，计算百分比，表示细胞纯度。
2.2 MTT法检测8-Br-cAMP、H-89、capsaicin、i RTX对大鼠DRG细胞的影响大鼠DRG细胞生长至对数生长期，以5×107·L-1浓度接种至24孔细胞培养板，37℃、5% CO2培养24 h。分为正常对照组、8-Br-cAMP组(200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)、H-89组(160、80、40、20、10、5 μmol·L-1)、capsaicin组(80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1)、i RTX组(16、8、4、2、1、0.5 μmol·L-1)，分别加入含药的无血清培养基，每孔加100 μL，设4个复孔，培养48 h，每孔加MTT溶液20 μL，孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μL DMSO，微量振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择570 nm波长，酶标仪测定各孔光吸收值。
2.3 8-Br-cAMP、H-89、capsaicin、i RTX对大鼠DRG细胞TRPV1、p-PKA作用研究大鼠DRG细胞以5×107·L-1浓度，接种于12孔板，分正常对照组(control)、8-Br-cAMP 50 μmol·L-1组、H-89 20 μmol·L-1组、capsaicin 25 μmol·L-1组、i RTX 2 μmol·L-1组，每组设4个复孔，重复3次，培养48 h后收集细胞，检测TRPV1、p-PKA基因、蛋白表达。
2.4 8-Br-cAMP、H-89、capsaicin、i RTX对大鼠DRG细胞TRPV1、p-PKA mRNA表达的影响定量PCR检测TRPV1、p-PKA mRNA，所需的引物序列见Tab 1。①RNA的抽提；②逆转录cDNA：逆转录反应体系的配制；将试剂盒从-80℃冰箱取出，复溶，将5×逆转录buffer、dNTPs、oligo(d T) 10 000 r·min-1，数秒。将经过稀释后的RNA样本进行定量PCR检测。mRNA表达的数据采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS Software分析。PCR扩增后，实时荧光定量PCR仪自动分析结果，根据阴性对照调整阈值和基线以确定各标本的Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。将结果导出，采用2-△△CT法分析目的基因在对照组和各浓度组之间的表达差异，计算公式如下：△Ct= Ct目的基因-Ct内参，再求得对照组△Ct的平均值，记为△Ct对照平均，用各组的△Ct分别减去△Ct对照平均，求得△△Ct值，即△△Ct=△Ct样本-△Ct对照平均，再计算各组2-△△CT值，即为各组中基因的相对表达量。
| Gene | Primer sequence (5’-3’) |
| β-actin (rat) | F: CACCCGCGAGTACAACCTTC |
| R: CCCATACCCACCATCACACC | |
| TRPV1(rat) | F: TGACAGCGAGTTCAAAGACC |
| R: CTGGCATTGACAAACTGCTT | |
| p-PKA(rat) | F: TACTTGGACCTTGTGTGGGA |
| R: CACCTTCCCAGAGACGATTT |
收集细胞，每组分别加入500 μL的RIPA裂解液，并加入适量的PMSF，置冰上裂解2 h；4℃、12 000 r·min-1离心10 min；移上清于新的EP管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱。蛋白定量后，SDS-PAGE电泳、转膜。膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min。加入相应二抗，与膜37℃孵育1 h。用TBST洗涤3次，每次10 min。显色，一体式化学发光仪拍摄照片。蛋白表达水平用目的条带积分吸光度值(integrated absorbance，IA)与内参β-actin条带的IA比值表示。
2.6 统计学分析实验结果采用x±s表示，用SPSS 13.0软件处理，多样本之间的组间比较采用单因素方差分析，进行SNK-Q检验。
3 结果 3.1 DRG神经元形态学特征Fig 1相差显微镜观察，可见DRG细胞神经元胞体有一定透亮度和折光性，突起分支十分茂密，可见少量神经胶质细胞及细胞碎片，少量非神经元细胞核。DRG神经元纯度结果显示，DRG神经元β-tubulin Ⅲ阳性细胞比例达到81%，细胞分离培养效果良好。
|
| Fig 1 Dorsal root ganglion cells of rats(scale bar=50 μm) |
由Tab 2可知，与正常对照组比较，8-Br-cAMP 200 μmol·L-1、H-89 160 μmol·L-1、capsaicin 200 μmol·L-1、i RTX 16、8 μmol·L-1使细胞增殖明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，故选择8-Br-cAMP 50 μmol·L-1、H-89 20 μmol·L-1、capsaicin 25 μmol·L-1、i RTX 2 μmol·L-1对细胞没有损害的浓度作为后续实验浓度。
| Group | Dose /μmol·L-1 |
Cell proliferation rate/% |
| Control | - | 78.74±0.04 |
| 8-Br-cAMP | 200 | 52.91±0.05* |
| 100 | 68.92±0.09 | |
| 50 | 78.21±0.08 | |
| 25 | 76.29±0.02 | |
| 12.5 | 77.84±0.06 | |
| 6.25 | 74.68±0.03 | |
| H-89 | 160 | 43.46±0.04** |
| 80 | 54.57±0.06* | |
| 40 | 67.95±0.07 | |
| 20 | 73.70±0.03 | |
| 10 | 72.84±0.04 | |
| 5 | 71.23±0.07 | |
| Capsaicin | 200 | 49.81±0.07* |
| 100 | 69.95±0.05 | |
| 50 | 75.26±0.03 | |
| 25 | 70.37±0.09 | |
| 125 | 76.09±0.05 | |
| 6.25 | 75.95±0.03 | |
| i RTX | 16 | 42.84±0.06** |
| 8 | 51.34±0.04* | |
| 4 | 62.56±0.04 | |
| 2 | 75.28±0.10 | |
| 1 | 77.93±0.08 | |
| 0.5 | 78.05±0.09 | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | ||
Tab 3结果显示，与正常对照组比较，8-Br-cAMP、capsaicin可明显促进TRPV1 mRNA的表达(P＜0.01)，i RTX可明显降低TRPV1 mRNA表达(P＜0.01)，H-89对TRPV1 mRNA表达的影响不明显；8-Br-cAMP可促进p-PKA mRNA的表达，H-89可降低p-PKA mRNA表达(P＜0.05)；capsaicin、i RTX对p-PKA mRNA表达的影响不明显。
| Group | Dose /μmol·L-1 |
TRPV1 | p-PKA |
| Control | - | 1.00±0.02 | 1.00±0.03 |
| 8-Br-cAMP | 50 | 1.17±0.03** | 1.21±0.01** |
| H-89 | 20 | 0.99±0.03 | 0.81±0.01* |
| Capsaicin | 25 | 1.17±0.02** | 1.02±0.03 |
| i RTX | 2 | 0.80±0.02** | 1.01±0.02 |
| *P＜0.05, **P < 0.01 vs control | |||
与正常对照组比较，8-Br-cAMP、capsaicin可明显促进TRPV1蛋白的表达(P＜0.01)，i RTX可明显降低TRPV1蛋白表达(P＜0.05)，H-89对TRPV1蛋白表达的影响不明显；8-Br-cAMP可促进p-PKA蛋白的表达，H-89可降低p-PKA蛋白表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)；capsaicin、i RTX对p-PKA蛋白表达的影响不明显(Fig 2)。
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| Fig 2 Expression of p-PKA, TRPV1 in different groups 1: Control; 2: 8-Br-cAMP(50 μmol·L-1); 3: H-89(20 μmol·L-1); 4: Capsaicin(25 μmol·L-1); 5: i RTX(2 μmol·L-1). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
TRP是一类重要的阳离子通道，在TRP通道中，感受温度变化及参与体温调节的有多个家族和通道蛋白，其中热敏感通道蛋白TRPV1分布广泛，是具有多功能的细胞感受器。TRPV1可被体内外多种物理化学因素激活，如伤害性热刺激、低pH值(酸性环境)、炎症、疼痛、辣椒素等。在疼痛的感知与调节、体温感知与调节、炎症的发生及中医寒热病证、中药寒热药性等方面研究中，TRPV1起着重要作用[7]。因此，探讨TRPV1体内的调控机制，有非常重要的意义。在TRPV1的活化中，磷酸化起着重要作用。Schnizler等[9]证实，PKA磷酸化作用增敏TRPV1通道由A激酶锚定蛋白AKAP150所介导。Bhave等[10]在转染TRPV1的cos7细胞中，给予辣椒素连续刺激后，产生急性脱敏现象；用8-Br-cAMP温育cos7细胞后，再给予辣椒素刺激，无急性脱敏现象；将PKA抑制剂与8-Br-cAMP一起温育cos7细胞，辣椒素刺激后，脱敏现象重新出现。还有研究表明，TRPV1的增强可促进cAMP的含量。可见cAMP/PKA信号通路引发的细胞磷酸化与TRPV1活化之间关系密切，TRPV1生理病理功能与cAMP/PKA通路的调控相关联。课题组前期研究表明，辛热药提高虚寒机体TRPV1活性同时，可上调机体cAMP/PKA信号通路。本实验从体外进一步探讨体内cAMP/PKA信号通路与TRPV1的调控关系，对TRPV1相关病症的研究有重要作用。
实验中采取胶原酶、胰酶消化分离DRG细胞的方法较为成熟，分离出的细胞形态较为完整，活性较强，纯度较高。应用cAMP/PKA通路激动剂8-Br-cAMP、抑制剂H-89和TRPV1的激动剂辣椒素、抑制剂i RTX进行干预。实验结果表明，8-Br-cAMP和H-89可明显上调或降低p-PKA基因、蛋白表达；capsaicin、i RTX可明显上调或降低TRPV1基因、蛋白表达；capsaicin、i RTX对p-PKA基因、蛋白的表达无明显影响，8-Br-cAMP可促进TRPV1的基因、蛋白的表达，H-89则对TRPV1的基因、蛋白的表达无明显影响。可见，TRPV1的激活或抑制对cAMP/PKA信号通路无明显影响，而cAMP/PKA信号通路激活可活化TRPV1，cAMP/PKA信号通路抑制时，对TRPV1基因、蛋白表达影响不大，可能除了cAMP-PKA信号通路可调控TRPV1的表达外，还存在其他信号通路对TRPV1也有一定调控作用，具体的调控机制还需在后期进一步深入研究。
( 致谢: 本实验在陕西中医药大学医学实验中心完成，感谢参与完成实验的课题组成员。)
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