在世界范围内，结肠癌是最为严重的恶性肿瘤之一[1]。目前在临床上治疗结肠癌最有效的方法是化疗，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)作为结肠癌治疗的基本化疗药物被广泛应用[2]，但是化疗后的远期生存率仍不理想。高死亡率很大程度上与肿瘤转移有关[3]，主要是因为患者对化疗药物产生了耐药性[4]。尽管对肿瘤转移和耐药的研究已经进行了很长时间，但是其复杂机制尚未完全明晰。
有研究报道，Wnt/β-catenin信号通路参与了多种肿瘤的发生、发展[5]，而在结肠癌中，Wnt/β-catenin信号通路也介导了结肠癌细胞的耐药[4]。在超过80%的结肠癌中可以观察到由于Wnt/β-catenin通路激活而导致细胞核中β-catenin积聚的现象，值得注意的是，该现象可能与结肠癌患者的不良预后有关[1]。
肿瘤转移过程中的关键步骤之一是肿瘤细胞的迁移与侵袭[6]，尽管大量研究发现很多物质如蛋白[7]、miRNA[8]、长链非编码RNA[9]等可以通过Wnt信号通路，影响细胞的迁移与侵袭能力，然而，抑制Wnt信号通路能否影响结肠癌细胞对化疗药物的耐受性，进而对细胞的迁移能力产生影响尚不可知。因此，本研究选用耐5-Fu人结肠癌细胞株HCT-8/5-Fu，并给予Wnt通路小分子抑制剂XAV939处理，探究Wnt信号通路与结肠癌耐药及迁移的可能关系。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人结肠癌野生型细胞株HCT-8/WT、耐5-Fu人结肠癌细胞株HCT-8/5-Fu，购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.1.2 试剂XAV939、5-Fu购自Sigma公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司；c-Myc、cyclin D1多克隆抗体购自万类生物公司；β-catenin、TATA结合蛋白(TATA binding protein, TBP)单克隆抗体，购自Abcam公司；GAPDH抗体购自Bioworld公司；羊抗鼠、羊抗兔辣根过氧化酶标记二抗购自Proteintech公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒，均购自碧云天生物技术有限公司。
1.1.3 仪器全功能微孔板检测仪(Bio Tek公司)；全能型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；正置显微镜(日本Olympus公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu细胞培养于含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、100 g·L-1链霉素溶液的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。
1.2.2 MTT法检测细胞活力将HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu细胞按每孔8 000个的数量接种于96孔板，Wnt通路抑制剂组中每孔含有终浓度10 μmol·L-1的XAV939。培养24 h后吸弃孔中培养基，加入倍比稀释的5-Fu，抑制组中每孔仍含10 μmol·L-1的XAV939。培养48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，避光继续培养4 h，每孔加入100 μL甲臜溶解液，孵育4 h后，取出96孔板于全功能微孔板检测仪检测570 nm处的吸光度值。
1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移将孔径8 μm的Transwell小室(BD Bioscience公司)放入配套的24孔板中，HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu细胞重悬于无血清的RPMI 1640培养基，使其终浓度为109·L-1，在上室加入100 μL细胞悬液，在下室加入500 μL含有10% FBS的RPMI 1640完全培养基，Wnt通路抑制剂组的下室添加10 μmol·L-1 XAV939，培养48 h后取出小室，4%多聚甲醛室温固定30 min，结晶紫染色20 min，PBS缓冲液洗涤干净后，风干，用显微镜观察穿入下室中的细胞，随机记录4个视野下的细胞数，取平均值。
1.2.4 划痕实验将细胞铺于12孔板，每孔细胞数为105个，Wnt通路抑制剂组中添加10 μmol·L-1 XAV939。待培养至细胞融合度达90%，进行划线操作，PBS洗去漂浮细胞，每孔加入含2% FBS的RPMI 1640培养基继续培养，在0 h和24 h给细胞拍照取样。采用边缘迁移距离法计算迁移率，即细胞迁移率=(边缘距离0 h -边缘距离24 h)/边缘距离0 h×100%。
1.2.5 Western blot检测β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达参照陈淑娴等[10]方法，收集细胞，PBS离心洗涤细胞3次，加入RIPA裂解细胞，提取细胞总蛋白质；细胞核蛋白、细胞质蛋白提取参照试剂盒说明书。检测蛋白浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液后，沸水热变性5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质转移至PVDF膜上，加入封闭液(TBST配制的5%脱脂奶粉)室温封闭4 h，分别加入抗β-catenin、c-Myc、cyclin D1、GAPDH、TBP一抗孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗涤，按ECL说明书显色，成像仪拍照。
1.2.6 统计学分析用Graph Pad 5.0软件进行分析，数据结果以x±s表示，组间比较采用Student’s t检验。
2 结果 2.1 HCT-8细胞耐药对迁移能力的影响MTT检测HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性，由Fig 1A可见，HCT-8/WT细胞对5-Fu的IC50为40.31 mg·L-1，而HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的IC50为472.5 mg·L-1，耐药指数近11.7(P < 0.05)。为探讨HCT-8细胞耐药性的差异是否影响其迁移能力，用Transwell实验和划痕实验检测HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu细胞的迁移能力。结果显示，与HCT-8/WT细胞相比，HCT-8/5-Fu细胞(蓝紫色)迁移数量明显增多(Fig 1B)，且划痕24 h后，HCT-8/5-Fu细胞迁移能力比HCT-8/WT细胞强(Fig 1C)。以上结果说明HCT-8细胞对5-Fu的耐受性越强，其迁移能力越强。
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| Fig 1 Effect of drug resistance of HCT-8 cells on migration ability (x±s, n=5) A: MTT assay was used to detect the sensitivity of HCT-8/WT and HCT-8/5-Fu cells to 5-Fu. The ability of cell migration of HCT-8/WT and HCT-8/5-Fu cells was measured by Transwell assay (B) and wound healing assay (C). Scale bar = 200 μm.*P < 0.05 vs HCT-8/WT. |
Western blot检测HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu细胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的表达。由Fig 2A可见，β-catenin在HCT-8/WT细胞中主要表达在细胞质，而在HCT-8/5-Fu细胞中主要表达在细胞核，说明β-catenin在细胞耐药的过程中发生了细胞质至细胞核的转移，且Wnt/β-catenin通路下游因子c-Myc、cyclin D1在HCT-8/5-Fu细胞中的表达水平明显高于HCT-8/WT细胞(Fig 2B)。当Wnt通路小分子抑制剂XAV939作用于HCT-8/5-Fu细胞后，HCT-8/5-Fu细胞核中β-catenin、细胞中c-Myc和cyclin D1蛋白表达量均降低(Fig 2C、2D)，且HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的耐受性下降(Fig 2E)。以上结果说明，Wnt/β-catenin通路可能参与并介导了HCT-8细胞的耐药。
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| Fig 2 Effect of Wnt/β-catenin pathway on drug resistance of HCT-8/5-Fu cells(x±s, n=4) Western blot was used to detect the protein levels of β-catenin expressed in the whole cells and the nucleus (A), as well as c-Myc and cyclin D1 (B) expressed in the whole cells. After treating with 10 μmol·L-1 XAV939 on HCT-8/5-Fu cells, the protein levels of β-catenin expressed in the whole cells and the nucleus (C), as well as c-Myc and cyclin D1 expressed in the whole cells (D) were validated by Western blot. E: MTT assay was used to detect the IC50 after treating 10 μmol·L-1 XAV939 on HCT-8/5-Fu cells. *P < 0.05 vs HCT-8/WT; #P < 0.05 vs HCT-8/5-Fu. |
由Fig 3A可见，与HCT-8/5-Fu细胞相比，HCT-8/5-Fu+XAV939细胞的迁移能力明显减弱(P < 0.05)，划痕实验结果也显示一致(Fig 3B)，说明XAV939通过影响HCT-8/5-Fu对5-Fu的耐受性，进而影响了细胞的迁移能力。
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| Fig 3 Effect of XAV939 on migration ability of HCT-8/5-Fu cells (x±s, n=5) After HCT-8/5-Fu cells were treated with 10 μmol·L-1 XAV939, the ability of migration of cells was measured by Transwell assay (A) and wound healing assay (B), respectively. Scale bar=200 μm. *P < 0.05 vs HCT-8/WT; #P < 0.05 vs HCT-8/5-Fu. |
自20世纪80年代以来，结肠癌在中国的发病率迅速上升[11]，而肿瘤转移是导致治疗失败的主要原因之一[12]。Wnt信号通路在结肠癌的发生和转移中起着重要作用[13]，同时也介导了结肠癌细胞的耐药[4]。本实验选用人结肠癌野生型细胞株HCT-8/WT和耐5-Fu人结肠癌细胞株HCT-8/5-Fu，首先探讨了两株细胞对5-Fu的耐受性，进而观察耐药的差异对细胞迁移能力的影响，结果发现HCT-8细胞对5-Fu敏感性越低，其迁移能力越强。为探讨Wnt信号通路能否影响结肠癌细胞对化疗药物的耐受性，进而对细胞的迁移能力产生影响，本研究用Western blot实验检测HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu细胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的表达水平，并在Wnt通路抑制剂XAV939处理HCT-8/5-Fu细胞后，用Western blot、MTT、Transwell和划痕实验分别检测了细胞中上述蛋白的表达水平、细胞对5-Fu的耐受性和细胞的迁移能力。结果显示，Wnt/β-catenin通路可能参与并介导了HCT-8细胞的耐药，其小分子抑制剂XAV939可通过抑制该通路，进而减弱耐药细胞的迁移。
5-Fu是治疗结肠癌最常用的药物之一，但临床上经常观察到患者对药物产生耐受性[14]，延长治疗会导致高转移癌细胞的进展或复发[15]。因此，理解结肠癌耐药与转移之间的关系可以为肿瘤的治疗提供靶点。本研究发现，HCT-8细胞对5-Fu耐受性的不同会导致细胞迁移能力的差异。
Wnt信号通路参与调节了细胞的自我更新和多种器官的形成，而该通路的紊乱会导致肿瘤的形成[13]。有研究报道，Wnt/β-catenin信号通路参与了结肠癌细胞的耐药，而Wnt通路小分子抑制剂XAV939可以通过降解β-catenin，进而破坏Wnt/β-catenin信号通路[4, 14-15]。本研究发现，HCT-8细胞在耐药的过程中，其细胞核中β-catenin由细胞质转移至细胞核，且下游因子c-Myc、cyclin D1蛋白表达水平升高，当XAV939作用于HCT-8/5-Fu细胞后，该细胞核中β-catenin蛋白表达减少，细胞中c-Myc、cyclin D1随之减少，并且HCT-8/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性提高。以上结果提示，Wnt/β-catenin通路可能参与并介导了HCT-8细胞的耐药。
有研究报道，很多物质通过Wnt信号通路影响了细胞的转移，如小GTPase超家族亚族成员RhoA蛋白的失活会导致β-catenin在细胞核中累积，增强Wnt/β-catenin信号转导，导致增殖、侵袭和去分化，促进结直肠癌的进展和转移[7]。microRNA-301a可以通过直接靶向同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)，激活Wnt/β-catenin通路，调节乳腺癌的发展和转移[8]。长链非编码RNA CASC11与异构核糖核蛋白K(heterogeneous ribonucleoprotein K, hnRNP-K)相互作用，并激活Wnt/β-catenin通路，促进结直肠癌的生长和转移[9]。本研究发现，Wnt通路小分子抑制剂XAV939作用于HCT-8/5-Fu细胞后，不仅可以降低细胞对5-Fu的耐受性，而且减弱了耐药细胞的迁移能力。
综上所述，人结肠癌细胞株HCT-8对5-Fu敏感性的差异影响了细胞的迁移能力，Wnt/β-catenin通路可能介导了HCT-8/5-Fu细胞的耐药，其小分子抑制剂XAV939可减弱耐药细胞的迁移，这一结果为临床上结肠癌化疗耐药的治疗提供了新思路。
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