心肌细胞肥厚、心肌成纤维细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积是心肌纤维化的典型组织学表现,并具有不可逆性[1]。氧化应激能够通过促进脂质、蛋白氧化,破坏细胞膜完整性,延迟细胞内信号传导,诱导心肌细胞凋亡和心肌成纤维细胞增殖等途径,促进心肌纤维化的发展[2]。转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)属于帽和领(Cap’n’Collar,CNC)转录因子家族成员。在氧化应激状态下,激活的Nrf2从细胞质转运至细胞核内,与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合后,上调下游多个抗氧化靶基因表达,包括血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶Ⅰ[NAD(P)H︰quinone oxidoreductase 1,NQO1]等[3]。积雪草酸(asiatic acid,AA)是从多年生草本植物积雪草(Centella asiatica)中提取的五环三萜烯类组分,广泛分布于多种蔬菜和水果中。AA具有抗增殖、抗凋亡、抗炎、抗氧化应激等多种药理学活性[4-5]。AA已被证实能通过上调Nrf2活性,减少氧化产物生成,抑制阿霉素诱导的心脏损害[6]。本研究以自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHRs)作为压力诱导心肌纤维化模型,观察AA的抗纤维化作用,并试图解释AA心血管保护作用与其抗氧化应激药理学活性之间的关系。
1 材料与方法 1.1 药物与试剂AA(纯度>98%,成都普瑞法生物有限公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、SOD、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)试剂盒,购自南京建成生物工程有限公司;兔抗大鼠胶原蛋白Ⅰ(collagen I,Col Ⅰ)、纤维黏连蛋白(febronectin,FN)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、血小板活化抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)、Nrf2、HO-1、NQO1、p-Akt、磷酸化糖原合酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、Fyn、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司);天狼星红染色液试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)。
1.2 实验动物8周龄健康♂SHR和Wky大鼠,SPF级,体质量200~230 g,购自中科院上海实验动物中心,动物生产许可证:SCXK(沪)2017-0005。依据处理方式不同,将大鼠分为4组:对照组(Wky)、SHRs组、SHRs+AA组(SHRs+AA 20 mg-1·kg-1·d-1)、AA组(Wky+AA 20 mg-1·kg-1·d-1),每组10只,连续灌胃12周。所有大鼠均饲养于郑州大学实验动物中心,适应性喂养1周后开始正式实验。饲养条件:温度(25±1)℃,相对湿度(45±5)%,每天光、暗各12 h,自由饮食进水。
1.3 大鼠体质量(BW)、收缩压(SBP)、心脏质量/体质量(HW/BW)指数和左心室质量/体质量(LVW/BW)指数测定实验期间,每2周使用电子体重计和鼠尾测压法,测定各组大鼠BW和SBP。实验终末,10%水合氯醛麻醉大鼠,快速取出心脏,生理盐水反复冲洗,滤纸将水分充分吸收。称量心脏质量,小心分离左心室并称重。将心脏质量和左心室质量同体质量相比,计算心脏指数。
1.4 大鼠血清SOD、T-AOC活性和MDA含量测定10%水合氯醛麻醉大鼠后,腹主动脉取血5 mL,3 000 r·min-1离心15 min,分离血清后-80℃冷冻保存。严格按照说明书操作流程,进行SOD、T-AOC活性和MDA含量测定。
1.5 天狼星红染色4%多聚甲醛固定大鼠左心室组织,石蜡包埋并切片。依据天狼星红染色液试剂盒操作流程,进行天狼星红滴染。偏光显微镜下观察左心室胶原蛋白沉积情况,胶原蛋白染色呈现红色或红棕色。
1.6 Western blot取大鼠心肌组织,使用含有1 mmol·L-1 PMSF的RIPA裂解液,在低温环境下进行研磨、充分裂解。核蛋白提取按照核蛋白提取试剂盒说明书操作。4℃、12 000 r·min-1离心15 min,收集组织上清液,使用BCA蛋白含量测定试剂盒进行蛋白含量测定。高温促使蛋白变性后,取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离,电转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭液封闭。加入一抗Nrf2 (1 :400)、NQO1(1 :500)、HO-1(1 :500)、p-Akt(1 :400)、p-GSK-3β(1 :400)、Fyn(1 :500)、β-actin(1 :4 000)和Histone(1 :1 000),4℃孵育过夜,TBST反复冲洗。加入二抗,室温孵育2 h,TBST反复冲洗。ECL化学发光法测定各组蛋白表达情况。
1.7 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计量数据用x±s表示。组间比较使用单因素方差分析,多重均数比较使用SNK检验。
2 结果 2.1 AA对SHRs大鼠BW、SBP、HW/BW和LVW/BW指数的影响Tab 1结果显示,各组间体质量无明显差别。同对照组相比,SHRs大鼠SBP、HW/BW和LVW/BW指数明显升高(P < 0.01)。给予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能有效降低SHRs大鼠SBP水平、HW/BW和LVW/BW指数(P < 0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周,不影响SBP水平、HW/BW和LVW/BW指数。
Group | SBP/mmHg | BW/g | LVW/BW/mg·g-1 | HW/BW/mg·g-1 |
Control | 132±5 | 362±6 | 2.14±0.04 | 3.22±0.07 |
SHRs | 208±6## | 360±7 | 2.33±0.06## | 3.46±0.08## |
SHRs+AA | 171±5** | 365±4 | 2.22±0.05** | 3.33±0.05** |
Wky+AA | 135±5 | 361±5 | 2.14±0.05 | 3.21±0.04 |
##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs SHRs |
如Fig 1所示,与对照组相比,SHRs组左心室胶原蛋白沉积水平明显增高。给予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能减少左心室胶原蛋白沉积。West-ern blot结果显示,与对照组相比,SHRs组心肌组织Col Ⅰ、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达明显增加(P < 0.01)。给予AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周,能降低SHRs大鼠心肌组织Col Ⅰ、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达(P < 0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周不影响心肌组织胶原沉积和Col Ⅰ、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达。
2.3 AA对SHRs大鼠SOD、T-AOC活性和MDA含量的影响Tab 2结果显示,与对照组相比,SHRs大鼠SOD、T-AOC活性明显降低,MDA含量明显增加(P < 0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能提高SHRs大鼠SOD、T-AOC活性,减少MDA含量(P < 0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周,不影响SOD、T-AOC活性和MDA含量。
Group | SOD/kU·L-1 | T-AOC/kU·L-1 | MDA/mmol·L-1 |
Control | 142.3±5.5 | 8.66±0.66 | 4.14±0.04 |
SHRs | 66.4±6.3## | 3.01±0.57## | 9.33±0.06## |
SHRs+AA | 111.7±5.8** | 6.45±0.58** | 6.22±0.05** |
Wky+AA | 145.3±5.4 | 8.61±0.75 | 4.16±0.05 |
##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs SHRs |
如Fig 2所示,与对照组相比,SHRs大鼠心肌组织Nrf2核转位水平及NQO1、HO-1蛋白表达明显降低(P < 0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能有效逆转压力负荷导致的Nrf2活性降低,以及NQO1、HO-1蛋白合成减少(P < 0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周,不影响Nrf2活性及NQO1、HO-1蛋白表达。
2.5 AA对SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位的影响有研究表明,Akt/GSK-3β/Fyn信号通路是Nrf2上游重要的调控途径。为了进一步探讨AA的抗纤维化活性和Nrf2抗氧化通路的关系,我们测定了SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位水平。如Fig 3所示,与对照组相比,SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化水平明显降低,细胞核内Fyn蛋白表达明显增加。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能明显逆转压力负荷诱导的Akt、GSK-3β磷酸化减少,抑制Fyn核转位增加。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周,不影响Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位水平。
3 讨论心肌纤维化是临床常见心血管疾病共同的病理学表现,它集中体现在ECM过度沉积、心肌细胞病理学凋亡和心肌成纤维细胞异常增殖,进而造成左心室扩张和心功能的明显下降。心肌纤维化具有不可逆性,至今尚无特效药物,成为临床治疗的难题[1]。心肌纤维化发病机制较为复杂,有研究表明,氧化应激与其发病具有密切关系[2]。生理条件下,心肌组织内氧化和抗氧化系统处于相对平衡状态,活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成处于较低水平,满足必要的生理活动。在病理条件下,尤其是压力负荷过重诱导的心肌纤维化过程中,伴随着心肌肥厚和ECM过度沉积,心肌组织处于相对缺氧状态,氧化和抗氧化系统平衡遭到破坏。氧化途径明显激活,而抗氧化能力降低,ROS合成明显增加。进而导致蛋白、脂质分子和核酸异常氧化,诱发信号传导异常,破坏细胞膜的完整性,线粒体功能异常和DNA链断裂,最终引起细胞功能异常、凋亡和坏死,促进纤维化[7]。因此,抑制心肌组织氧化应激反应和减少ROS生成,可能成为逆转心肌纤维化的治疗药物作用靶点。
伴随着SBP逐渐升高,SHRs心肌组织内胶原蛋白沉积和促纤因子的表达均明显升高。ECM代谢异常,集中体现于胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成增多和代谢减少,导致心肌顺应性降低和收缩功能障碍,最终造成心脏形态学和功能学的改变。CTGF和PAI-1通过促进心肌成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成增加和抑制金属蛋白酶活性等途径,促进心肌纤维化的发生和发展。已有研究表明,减少CTGF和PAI-1表达,能够一定程度抑制心肌纤维化[8]。AA已被证实能够抑制L-NAME诱导的高血压大鼠主动脉弓部胶原蛋白沉积[9]。本研究发现,AA干预能有效减少Col Ⅰ、FN、CTGF及PAI-1表达。这预示着AA可能通过影响ECM,尤其是胶原蛋白的代谢和促纤因子的表达,发挥抑制压力负荷诱导的心肌纤维化作用。
SOD是心肌组织内重要的抗氧化酶,能够有效减少ROS生成,清除超氧阴离子,SOD活性水平被认为是评判机体抗氧化能力重要指标。T-AOC可以较为全面地反映心肌组织内抗氧化物质的总体活性,帮助评估心肌组织对ROS清除能力。MDA是细胞膜过氧化的重要产物之一,其含量是反映机体氧化应激水平的一个常用指标[2]。前期研究证实,AA能够有效抑制博来霉素诱导的肺成纤维细胞SOD活性降低和MDA生成增多[10]。我们发现,AA干预能够有效增强SHRs大鼠心肌组织SOD和T-AOC活性,降低MDA含量。结果提示,AA可能通过恢复氧化/抗氧化系统再平衡,增强抗氧化酶活力,减少氧化产物的方式,延缓心肌纤维化进展。
Nrf2激活并与保护性蛋白DNA上游调节区的ARE结合,进而上调下游抗氧化物质表达,是机体最重要的内源性抗氧化信号通路[3]。Nrf2已被证实广泛分布于心脏和血管组织内,同心肌组织抗氧化应激能力密切相关。在发生氧化应激反应时,Nrf2合成增加,同时无活性的Nrf2蛋白与其伴侣蛋白Keap1解离,Nrf2进入活化状态,由细胞质进入细胞核,再与ARE结合,上调抗氧化相关基因HO-1、NQO1的表达,最终起到抗氧化作用。已有研究表明,增强Nrf2抗氧化信号通路活性,能够有效减轻糖尿病心肌损害和缺血诱导的心肌重塑[11]。AA被证明能够通过激活Nrf2,上调HO-1和NQO1表达,减少ROS和MDA生成,减轻阿霉素诱导的心脏和肾脏损害[6]。本研究发现,伴随SHRs心肌组织内氧化应激水平降低,AA干预能够促进Nrf2核转位,上调抗氧化因子HO-1、NQO1表达。结果提示,AA可能通过上调心肌组织抗氧化能力,减少氧化自由基生成,最终抑制心肌纤维化的发展。
有研究表明,伴随GSK-3β磷酸化水平降低,Fyn核转位水平明显提高,进而通过限制Nrf2核内转运,抑制Nrf2对下游抗氧化基因的上调作用[12]。我们发现,在增强Nrf2活性同时,AA能够有效增加SHRs心肌组织内GSK-3β磷酸化,并抑制Fyn核转位。为了进一步探讨AA调控Nrf2的信号机制,我们又观察了Akt的磷酸化水平。作为GSK-3β磷酸化的上游调控分子,Akt磷酸化减少也被证实能够抑制Nrf2核转位[13]。我们发现,AA干预能够明显抑制压力负荷诱导的Akt磷酸化水平降低。以上结果提示,AA可能通过增强Akt、GSK-3β磷酸化,并抑制Fyn核转位,上调纤维化大鼠心肌组织Nrf2活性。
综上所述,AA通过激活Nrf2诱导的内源性抗氧化信号通路,减少SHRs心肌组织氧化应激反应,抑制压力负荷导致的心肌纤维化。同时,AA的Nrf2活化作用,可能与其对Akt/GSK-3β/Fyn信号通路的调节作用相关。
( 致谢: 本课题在郑州大学第一附属医院重点实验室完成,特别感谢实验的指导老师及各位参与者!)
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