2. 新乡医学院 护理学院, 河南 新乡 453003;
3. 西安交通大学医学部基础医学院药理学系，陕西 西安 710061
2. the Nursing College, Xinxiang Medical University, Xinxiang, Henan 453003, China;
3. Dept of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University Health Science Center, Xi'an 710061, China
抑郁症是一种严重危害人类身心健康的情感障碍性精神疾病, 致残率和自杀率高。目前，全球抑郁症的发病率约为3.1%，在发达国家接近6%[1]，严重威胁着人类的健康与生命。其发病机制不明，致使抗抑郁的药物疗效有限。如传统的选择性5-HT再摄取抑制剂，约有超40%的患者对治疗无反应，且经常发生耐药和症状的复发[2-3]。因此，继续发现和探索抗抑郁的新药及其作用机制十分重要。
近年来，中医、中药作为研究抑郁的发病机制与抗抑郁的药用资源引发了人们的关注。一些研究发现[4-5]，小柴胡和醒脾解淤汤均可明显缓解啮齿类动物的抑郁症状，改善精神状态。基于同样的视角，我们自拟了健脾益气方药(self-made prescription of strengthening spleen and replenishing Qi, SMP-SSRQ)，预实验发现其能明显改善小鼠的抑郁样行为，但其抗抑郁的作用及分子机制尚需更深的研究。我们前期研究还发现，抑郁模型小鼠脾脏组织中的免疫球蛋白超家族11(immunoglobulin superfamily member11，Igsf11)基因表达上调，蛋白质二硫键异构酶2(protein disulfide isomerase associated 2，Pdia2)和生育酚结合蛋白(SEC14-like 2，Sec14l2)基因表达下调[6]，而此3个基因均可通过激活核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路，促进炎症反应[7-8]。神经炎症是抑郁症的重要病理基础，NF-κB在氧化应激性神经损伤和抑郁症中起着关键性的调节作用[9]。据此可推测，Igsf11、Pdia2、Sec14l2/NF-κB信号通路可能参与了抑郁症的发生、发展，且SMP-SSRQ可能通过调节该信号通路发挥抗抑郁作用。因此，本研究旨在进一步探索SMP-SSRQ的抗抑郁作用及其对抑郁小鼠大脑皮层前额叶、海马组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白表达的影响。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器蔗糖，购自天津市德恩化学试剂有限公司；RNA Keeper Tissue Stabilizer，购自Vazyme公司；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，均购自碧云天生物技术研究所；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒、抗β-actin单克隆抗体，购自康为世纪生物科技有限公司；Igsf11抗体购自EterLife公司；抗Pdia2和抗Sec14l2抗体，购自Abcam公司；SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司。502B型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；SHZ-DIII循环水式真空泵，河南巩义市予华仪器有限责任公司；Forma 900 -80℃超低温冰箱、TDZ5-WS高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher公司；SpectraMax M5多功能酶标仪，Molecular Devices公司；ABI Veriti96孔梯度PCR仪，美国ABI公司；GeLDos-It2 Imagers凝胶成像系统，美国UVP公司；DYY-7C型水平电泳仪，北京市六一仪器厂；PowerPacTM电泳仪、转膜仪美国Bio-Rad公司。
1.2 实验药物的制备SMP-SSRQ方药主要由白术30 g、大枣20 g、菟丝子10 g、陈皮10 g、熟地黄5 g、金银花5 g等6味中药组成(处方中药物均购于新乡市胖东来医药超市)。将该组方和体积分数为0.80的无水乙醇按g :mL=1 :10比例在浸药桶内充分混匀，封口，冷浸10 d，期间每天早晚各充分摇晃1次，收集浸出液，将滤渣再用80%无水乙醇冷浸7 d，收集浸出液。所有浸出液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得浸膏，每1 g浸膏含生药量0.4 g，4℃冰箱保存备用。小鼠给药剂量(g·kg-1)=0.018(系数) ×5×成人剂量(g·kg-1)(公式参考《中药药理方法学》), 一般人中药常用内服剂量为5~10 g, 按公式计算出浸膏的给药范围为0.45~0.9 g，所含生药量为0.18~0.36 g。先用小鼠探索该药物的中毒剂量或致死剂量，取小于中毒量的剂量为最高剂量组，然后依次设置几个剂量组进行抗抑郁药效的预实验，最后根据预实验结果确定动物的给药剂量。
1.3 建立慢性不可预知性温和应激抑郁小鼠模型参照文献方法[10]，制备慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)抑郁模型，应激刺激包括：禁食24 h，禁水24 h，束缚2 h，夹尾倒挂30 min，潮湿垫料24 h，45℃倾斜鼠笼24 h，冰水游泳6 min，明暗颠倒，空笼饲养12 h。正常组不给予任何刺激，正常饲养。其余各组进行21 d CUMS刺激，每天随机选取1套不同顺序的刺激方法进行刺激，相同顺序刺激的方法不能连续使用，同1套顺序刺激的方法不能超过3次使用，使小鼠不能预知次日刺激，以免影响实验结果。
1.4 实验动物分组及给药BALB/c清洁级健康小鼠60只，♀♂各半，体质量(20±2)g，7~8周龄，购自华兰生物疫苗有限公司，实验动物质量合格证号：No.41001700001781。小鼠适应性饲养1周，饲养条件：室温(25±2)℃，相对湿度(45±10)%，饲养室光照12 h、黑暗12 h交替，自由摄食、饮水。所有实验步骤和实验动物的照料均遵照2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准，并经过新乡医学院动物实验伦理委员会批准。小鼠自由饲养1周后，所有小鼠进行旷场、糖水偏好、强迫游泳及悬尾等实验，将水平移动格数在70~100，同时这些动物糖水偏好指数在0.4~0.6，强迫游泳不动时间在70~90 s，悬尾不动时间在30~50 s范围外的动物剔除，以保证组间的差异最小。根据行为学观察的结果及随机区组设计，将小鼠随机分成5组：正常组(Control)、模型组(Model)、SMP-SSRQ低、中、高剂量组(8、16、32 mg·kg-1)，每组12只(♀♂各6只，分开饲养)。模型构建结束后，进行各项行为学测试，判断模型构建是否成功。正常对照组和模型组均给予生理盐水，SMP-SSRQ各剂量组小鼠给予相应剂量的SMP-SSRQ，按每10 g体质量给药0.2 mL的体积进行给药，每天早晚各1次，连续灌胃14 d。
1.5 行为学检测 1.5.1 旷场实验本实验的敞箱装置为四周及底面全部为黑色的无盖方箱，方箱规格为80 cm×80 cm×45 cm，底面用白线划分成20 cm×20 cm的16个方格。本实验需在安静环境下进行，首先将小鼠置于暗箱中心方格内，适应2 min后，观察小鼠5 min内的活动情况。观察指标，①水平运动：以小鼠穿越底面格数(至少3爪进入方格)为水平运动得分，每穿越1格得1分，依次累计；②垂直运动：以小鼠前两肢直立次数为垂直运动得分，每直立1次得1分，依次累计。每次测定后须用低浓度乙醇将箱底擦拭干净，避免残留气味干扰下一只小鼠的测定。记录造模成功后和给药14 d后各组小鼠的旷场得分情况。
1.5.2 糖水偏好实验实验前，先训练小鼠适应含糖饮水，需3 d时间。第1个24 h，放两瓶均装有1%(W/V)的蔗糖水；随后24 h，1瓶装有1%的蔗糖水，1瓶纯水；在最后24 h，先将装有蔗糖水的瓶子和装有纯水的位置进行调换12 h，以防止动物对饮水位置的偏好而干扰实验；接着，再禁食禁水12 h后，进行动物糖水偏好实验。同时给予每笼小鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水100 mL，1瓶纯水100 mL，12 h后，取走2个饮水瓶进行称量，记录小鼠糖水消耗体积、纯水消耗体积，并计算小鼠糖水偏好指数。动物糖水偏好指数公式，糖水偏好指数/%=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。给药14 d后进行1次糖水偏好实验，计算小鼠糖水偏好指数。
1.5.3 强迫游泳实验准备好高20 cm，直径14 cm的圆柱形玻璃缸数个，每缸加入(25±1)℃的水，使水深度保持在10 cm。实验时，每次每杯1只动物。实验前24 h，先对每只小鼠进行游泳训练10 min，随后用电吹风吹干毛发后放回笼中，24 h后再进行正式实验。实验时将小鼠放于缸中游泳6 min，然后记录后5 min内小鼠的累积不动时间。不动时间是指小鼠漂浮在水上，没有挣扎或仅有细小的肢体运动，使头部浮在水面。
1.5.4 悬尾实验将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于自行架构的钢制横杆上，使小鼠头部距离台面15 cm，在黑色背景下进行观察摄像6 min。然后，计数后5 min内小鼠的不动时间。
1.6 取材和组织样本的处理测定完行为学指标后，脊椎脱臼法处死小鼠，冰上快速取脑，然后小心去除脑膜。头前部最外层组织即为前额皮层组织，皮质下面的八字形白色组织即为海马组织，将6只小鼠的大脑皮层前额叶、海马分别迅速放入1.5 mL离心管中，-80℃冰箱保存，用于Western blot检测。另外6只小鼠的大脑皮层前额叶和海马分别放入无RNA酶、DNA酶、无热源的1.5 mL离心管中，分别立即加入1mL RNA Keeper Tissue Stabilizer，放入4℃冰箱，待组织块沉降至液面下后，转移至-80℃冰箱保存，用于qPCR检测。
1.7 实时荧光定量PCR将所需组织从-80℃冰箱中取出，在冰上磨碎。用TRIzol试剂提取各组样本中的总RNA，并进行RNA纯度分析。用HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。取各样本中2 μL的cDNA，用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行qRT-PCR检测。引物序列见Tab 1。PCR条件为：95 ℃ 30 s，1个循环; 95℃ 5 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 45个循环。以β-actin作内参对照，假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%，且相对偏差不超过5%，用2-ΔΔCt方法计算相对表达量，进行定量分析。
| Gene | Primer sequence | |
| Igsf11 | Forward | 5′-CGCTCAAGCTACCTCCAACA-3′ |
| Reverse | 5′-CCGGCTATTACTCCAACGCT-3′ | |
| Pdia2 | Forward | 5′-TCCCGCTTCCTCGTCATACAT-3′ |
| Reverse | 5′-GCTAGTGTCTGGTTCACAAACAG-3′ | |
| Sec14l2 | Forward | 5′-AGAGGCCATGCTCCGAAAG-3′ |
| Reverse | 5′-TCCAAGTCGTAGCCACATCTG-3′ | |
| β-actin | Forward | 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′ |
| Reverse | 5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′ |
用蛋白提取试剂盒分别提取各组小鼠大脑前额皮层和海马组织的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。50μg的蛋白用SDS-PAGE进行电泳分离，并转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶室温下于脱色摇床上封闭2 h。然后加一抗Igsf11(1 :500)、Sec14l2(1 :2 000)、Pdia2(1 :1 000)、β-actin(1 :2 000)，4℃孵育过夜。1×PBST缓冲液于脱色摇床上洗涤3次后，加羊抗兔二抗，室温孵育2 h。实验条带用凝胶成像系统进行摄像，每一条带的灰度值用Image J图像分析软件进行测定。目的蛋白条带的灰度值除以相应的β-actin的信号灰度水平进行标准化处理。
1.9 统计学分析数据的统计分析采用SPSS 19.0软件进行。所有计量结果均采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多样本均数间两两比较采用LSD法进行分析。
2 结果 2.1 SMP-SSRQ改善抑郁模型小鼠的行为学指标CUMS刺激21 d后，模型组小鼠的水平移动格数、直立次数和糖水偏好指数均下降，而强迫游泳与悬尾不动时间均增加，与正常对照组比较差异有显著性(P < 0.05，P < 0.01)。用SMP-SSRQ灌胃治疗2周后，SMP-SSRQ各剂量组小鼠的水平移动格数、直立次数及糖水偏好指数均增加, 强迫游泳和悬尾不动时间明显减少，与模型组比较差异均有显著性(P < 0.05, P < 0.01)。见Tab 2、3。
| Group | Horizontal mobile score | Upright number | Sugar water preference index |
| Control | 91.33±9.47 | 11.00±0.71 | 0.52±0.04 |
| Model | 38.83±7.13** | 2.40±0.50** | 0.41±0.07* |
| SSRQ-L | 53.67±7.94**## | 4.10±0.54**# | 0.52±0.07# |
| SSRQ-M | 56.66±8.23**## | 4.50±0.67**# | 0.54±0.06# |
| SSRQ-H | 63.33±5.16**## | 5.60±0.81**## | 0.58±0.07# |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | |||
| Group | FST/s | TST/s |
| Control | 78.45±9.25 | 40.00±8.51 |
| Model | 109.25±10.26** | 101.25±18.50** |
| SSRQ-L | 98.67±8.34**# | 85.28±15.54**# |
| SSRQ-M | 92.26±11.20*# | 70.50±14.47**## |
| SSRQ-H | 81.22±9.16## | 55.60±0.81*## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | ||
由于实验药物低、高剂量组在药理学作用上差异较大，故本实验部分选取正常对照组、模型组、SSRQ-L组和SSRQ-H组进行研究。Tab 4结果显示，模型组小鼠大脑皮层前额叶组织内的Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA表达量明显升高，与对正常对照组比较差异有显著性(P < 0.05，P < 0.01)；经药物治疗14 d后，SMP-SSRQ各剂量组均剂量依赖性地减少了小鼠大脑皮层组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA的表达量，与模型组比较差异均有显著性(P < 0.05，P < 0.01)。
| Group | Igsf11 | Pdia2 | Sec14l2 |
| Control | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| Model | 1.60±0.21** | 1.89±0.18** | 1.20±0.10* |
| SSRQ -L | 1.21±0.24*## | 1.33±0.34*## | 0.93±0.14# |
| SSRQ-H | 0.97±0.11## | 0.90±0.16## | 0.87±0.13## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | |||
Tab 5结果显示，与对照组比较，模型组小鼠海马内Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA表达量均明显增加(P < 0.05，P < 0.01)；给药治疗后，SMP-SSRQ各剂量组小鼠海马组织内的Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA表达量呈剂量依赖性降低，与模型组比较差异有显著性(P < 0.05，P < 0.01)。
| Group | Igsf11 | Pdia2 | Sec14l2 |
| Control | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| Model | 2.26±0.21** | 1.89±0.12** | 1.67±0.32* |
| SSRQ-L | 1.70±0.51**# | 1.53±0.08#** | 1.22±0.26# |
| SSRQ-H | 1.25±0.45 ## | 0.86±0.04## | 0.87±0.10## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | |||
CUMS刺激后，模型组小鼠大脑皮层前额叶Igsf11、Pdia2、Sec14l2蛋白表达量均升高，与对照组比较差异有显著性(P < 0.01)；用药后，SMP-SSRQ各剂量组小鼠呈剂量依赖性地降低其皮层前额叶组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2蛋白的表达，与模型组比较差异均有显著性(P < 0.05，P < 0.01)。见Fig 1。
|
| Fig 1 Effect of SMP-SSRQ on Igsf11, Pdia2 and Sec14l2 protein expression in frontal cortex of mice(x±s, n=6) 1: Control; 2: Model; 3: SSRQ-L; 4: SSRQ-H. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model. |
经过21 d CUMS刺激后，模型组小鼠海马组织内Igsf11、Pdia2、Sec14l2蛋白表达量均升高，与对照组比较差异有显著性(P < 0.05，P < 0.0, 1)；用药后，SMP-SSRQ各剂量组均可剂量依赖性地降低Igsf11、Pdia2、Sec14l2蛋白的表达，与模型组比较差异有显著性(P < 0.05，P < 0.01)。见Fig 2。
|
| Fig 2 Effect of SMP-SSRQ on Igsf11, Pdia2 and Sec14l2 protein expression in hippocampus of mice(x±s, n=6) 1: Control; 2: Model; 3: SSRQ-L; 4: SSRQ-H. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model. |
本研究主要有以下几个发现[10]：① SMP-SSRQ可明显改善小鼠的抑郁症状，具有良好的抗抑郁作用；② SMP-SSRQ低、高剂量组可降低抑郁小鼠大脑皮层前额叶组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白的表达；③ SMP-SSRQ低、高剂量组能减少海马组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白的表达。
CUMS模型是目前比较公认的一种抑郁模型，该模型很好的模拟了人类抑郁症心境低落、快感缺失等症状，是被广泛用于探索抑郁症的病理机制和筛选抗抑郁药的有效、可靠的模型。我们的结果发现，小鼠经过21 d的CUMS后，抑郁小鼠的水平移动格数和直立次数减少，糖水偏好指数下降，强迫游泳和悬尾不动时间增加，这些行为学指标说明小鼠已出现抑郁行为，提示抑郁小鼠模型构建成功。用SMP-SSRQ治疗抑郁小鼠2周后，抑郁动物的水平移动格数、直立次数和糖水偏好指数明显增加，强迫游泳及悬尾不动时间有效减少，此结果同其它研究抗抑郁药物作用的文献报道一致[11]，提示SMP-SSRQ有良好的抗抑郁活性。
抑郁症的发病原因和发生机制至今尚不清楚，目前多数学者认为抑郁症的发生与脑内神经功能失衡、免疫反应异常、神经生长因子失调等密切相关。大量研究发现，抑郁患者和抑郁小鼠皮层、海马神经元均有不同程度的损伤，从而导致患者认知、记忆、学习等功能发生障碍[12-13]。因此，我们在实验中分别选择大脑皮层前额叶和海马组织，研究SMP-SSRQ对Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白表达的影响。结果发现，用SMP-SSRQ治疗抑郁小鼠2周后，使大脑皮层前额叶与海马组织中的Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA的表达水平明显减少，其蛋白的表达在以上两部位的趋势与基因完全一致。本次结果还发现，用CUMS应激所致的抑郁模型小鼠的皮层前额叶、海马组织中Igsf11 mRNA及其蛋白表达量均升高，此与我们课题组前期研究中发现皮质酮应激所致的抑郁小鼠脾脏组织中的Igsf11表达上调的结果一致，这些结果提示抑郁症的发生发展可能与Igsf11激活大量的炎症因子有关。用SMP-SSRQ干预治疗后发现，Igsf11 mRNA及其蛋白在以上两部位组织中表达均下调，小鼠的抑郁行为得到了明显的改善。然而，在本次实验中，抑郁小鼠大脑皮质前额叶和海马组织中Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白表达水平的增高，与以往本课题组研究抑郁小鼠脾脏组织中两基因表达下调的结果不一致，这可能与两次实验所采用的模型不同，以及所选取的实验部位不同有关。
从前述可知，Igsf11、Pdia2、Sec14l2均可通过NF-κB途径产生炎症反应和氧化应激，而炎症反应和氧化应激均与抑郁症的发生发展密切相关[14]。虽说炎症反应和氧化应激与抑郁症的因果关系目前难以确定，但抑郁症往往伴发有炎症反应和氧化应激状态。我们的研究发现，SMP-SSRQ能够通过减少抑郁小鼠大脑皮质前额叶和海马组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2基因与蛋白的表达，改善小鼠的抑郁症状，这至少说明以上3个基因和蛋白的表达增高可能是抑郁症的不利因素，用SMP-SSRQ治疗可通过降低它们的表达而缓解抑郁。当前，除了我们以往的研究发现Igsf11、Pdia2、Sec14l2基因在抑郁症时发生了改变外，并没有其他文献支持Igsf11、Pdia2与抑郁症的发生发展存在直接的因果关系，但两者均与NF-κB通路存在关联，而NF-κB的激活与抑郁症的发生发展密切相关。引人注意的是，最近研究发现，Sec14l2在炎症中可诱导HMGB1的释放，通过NF-κB途径激活神经炎症反应，诱导抑郁样行为[15]。我们的研究结果显示，Sec14l2在抑郁模型小鼠大脑皮质前额叶和海马组织中的表达增高，与该研究结果相一致。这说明我们的实验结果可能从一个侧面揭示了Igsf11、Pdia2、Sec14l2与抑郁症的关系。
SMP-SSRQ方药中的制大枣和白术健脾益气，宁心安神为君药；菟丝子滋补肝肾、温煦肾阳为臣药；熟地黄滋阴补血，益精填髓为佐药；陈皮理气、除痰湿，金银花清热解毒、增固免疫为使药。诸药合用能够补脾虚、化生气血、气顺肝疏，达到消除抑郁和恢复情志的目的。总之，本研究较为充分地证实，SMP-SSRQ具有良好的抗抑郁作用，其作用机制可能与其下调抑郁模型小鼠大脑皮质前额叶和海马组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及其蛋白的表达，进而抑制NF-κB的信号通路有关。但它们与NF-κB之间的调控关系，及SMP-SSRQ对其关系产生的影响，SMP-SSRQ后期的安全性评价则是下一步工作需要继续研究的。
( 致谢: 本文实验主要于新乡医学院神经精神分子药理学实验室完成，在整个研究过程中得到了黄锋博士、牛慧芳博士的细心指导和耐心帮助，在此深表感谢！)
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