乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均很高，化疗在其综合治疗中起着不可取代的作用。但多药耐药(multidrug resistance, MDR)是乳腺癌化疗成功的主要障碍之一。研究表明，多种机制参与MDR的产生、发展过程，其中乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的过度表达是乳腺癌MDR形成的重要机制之一[1]。BCRP被证实为肿瘤干细胞的标记物之一[2]，是耐药肿瘤复发和转移的重要原因。因此，克服BCRP介导的MDR是当前乳腺癌治疗中的难点和热点问题。
黄芩素是从中药黄芩根部分离得到的有效单体。近年来，多项研究证实黄芩素可通过抑制细胞迁移[3]、增强凋亡[4]等产生明显的抗肿瘤作用。但有关黄芩素与乳腺癌MDR关系的研究较少，尤其对BCRP介导的MDR作用，国内外尚未见文献报道。因此，本实验以人乳腺癌敏感株MCF-7和米托蒽醌(mitoxantrone, MX)诱导的、BCRP高表达的乳腺癌耐药株MCF-7/MX为细胞模型，通过MTT及Western blot等实验，研究黄芩素对BCRP介导的MDR的逆转作用及可能机制，为提高乳腺癌的化疗效果提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人乳腺癌敏感细胞株MCF-7及耐药细胞株MCF-7/MX由美国国家癌症研究所Cowan博士馈赠。黄芩素(baicalein, 纯度≥98.0%，批号JPJYH-SI)购自东京化成工业株式会社，以少量DMSO溶解，再用生理盐水配成4 mmol·L-1的母液，临用时用RMPI 1640培养液稀释成相应浓度；四甲基偶氮唑盐(MTT)粉末、盐酸米托蒽醌注射液(mitoxantrone hydrochloride, MX, 纯度≥95.0%)购自美国Sigma公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU, 批号FA160305)注射液购自上海旭东海普药业有限公司；顺铂(cisplatin, DDP, 批号161004)注射液购自江苏豪森药业集团有限公司；RMPI 1640培养基购自美国Hyclone公司；优质胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、BCRP、NF-κB p65多克隆抗体、β-actin单克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司；p38 MAPK和p-p38 MAPK单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 仪器SMATB全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；ChemiDoc XRS凝胶成像系统、Mini-PROTEAN垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3 细胞培养MCF-7及MCF-7/MX细胞均以含10% FBS的RMPI 1640完全培养基，于37℃条件下在5% CO2细胞培养箱中培养。为维持MCF-7/MX的耐药性，需在上述细胞培养液中加入终浓度为400 μg·L-1的MX，实验前2周撤去MX。
1.4 MTT法确定黄芩素对MCF-7/MX细胞逆转耐药的浓度取对数生长期的细胞MCF-7及MCF-7/MX，接种于96孔板(2×103/孔)，培养24 h后，加入不同浓度的黄芩素(终浓度为640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1)，另设阴性对照组(Control)，每组6个复孔。培养68 h后，每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h，吸去孔内液体后，每孔加入200 μL DMSO，振摇10 min后，用酶标仪于波长570 nm测吸光度(OD)值，计算各浓度的抑制率(inhibition rate, IR)和相对存活率，并绘制细胞增殖抑制曲线，选取IR≤ 15%的浓度作为耐药逆转浓度。实验重复3次。IR/%=[(对照组OD值-加药组OD值)/对照组OD值]× 100%。
1.5 MTT法测定黄芩素对MCF-7/MX细胞的逆转耐药作用按照上述方法接种细胞MCF-7及MCF-7/MX，培养24 h后，将MCF-7/MX分为对照组和实验组。对照组和MCF-7组只加入不同浓度的化疗药物，实验组同时加入黄芩素及不同浓度的化疗药物，其中黄芩素浓度为上述实验确定的逆转浓度；化疗药物包括MX、5-FU、DDP 3种，每组6个复孔，实验重复3次。计算各组细胞对不同化疗药物的IC50值，按照以下公式计算耐药指数(resistance index, RI)以及黄芩素的逆转倍数和相对逆转率：RI=IC50/IC50(MCF-7)；逆转倍数=IC50A/IC50B；相对逆转率/%=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)×100%。其中，IC50A和IC50B分别为黄芩素作用前、后MCF-7/MX细胞对不同化疗药物的IC50值，IC50C为MCF-7细胞对不同化疗药物的IC50值。
1.6 Western blot法检测BCRP、NF-κB p65、p-p38蛋白的表达差异取对数生长期的MCF-7及MCF-7/MX细胞，接种于6孔板(1.0×105/孔)，培养24 h后，加入逆转浓度的黄芩素，空白组加入等量的生理盐水，继续培养72 h后，每孔加入蛋白裂解液，冰浴裂解1 h，离心收集上清至预冷离心管中，采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶中电泳1.5 ~ 2 h，用半干法将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上。将膜在5%脱脂奶粉室温封闭2 ~ 3 h，以一定稀释度的一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(1 :5 000)，置摇床室温孵育1 h。避光加入ECL发光液，用凝胶成像系统曝光成像。以β-actin或p38为内参，将条带标准化，分析蛋白的相对表达水平。
1.7 统计学处理计量资料采用x±s表示，采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，采用GraphPad Prism 7.0作图，两样本之间比较采用t检验，多组间比较釆用单因素方差分析进行显著性检验。
2 结果 2.1 MCF-7/MX细胞的MDR表型Fig 1的MTT结果表明，与MCF-7敏感株相比，MCF-7/MX对MX、5-FU、DDP的耐药倍数分别为：70.45、6.68、21.47。Fig 3的Western blot结果表明，相对于敏感株MCF-7细胞，MCF-7/MX细胞的BCRP高表达(P < 0.01)。这些结果证实BCRP是介导MCF-7/MX细胞MDR的重要机制。经黄芩素作用72 h后，MCF-7和MCF-7/MX细胞的IC50分别为28.59 μmol·L-1和27.42 μmol·L-1，差异无显著性(P>0.05)，证实黄芩素对敏感株MCF-7和耐药株MCF-7/MX均有杀伤作用，提示黄芩素对MCF-7/MX细胞可能有逆转耐药作用。
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| Fig 1 Resistance of MCF-7 and MCF-7/MX cells to different agents (x±s, n=3) **P < 0.01 vs MCF-7 cells. IC50 values represent the mean of three independent experiments. |
黄芩素(2.5 ~ 640 μmol·L-1)浓度依赖性地抑制MCF-7/MX细胞的增殖。2.5、5 μmol·L-1的黄芩素对MCF/MX细胞的IR分别为(7.06±1.23)%和(13.44±1.88)%，均小于15%，被选择为逆转耐药浓度做后续实验(Fig 2)。
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| Fig 2 Effects of baicalein on proliferative inhibition (A) and relative viability (B) in MCF-7/MX cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs control |
2.5、5 μmol·L-1黄芩素与MX、DDP、5-FU联合使用，可增强MCF-7/MX细胞对这些化疗药物的敏感性(Tab 1)。2.5、5 μmol·L-1的黄芩素对上述3种化疗药物的逆转倍数分别为(3.57、15.44)、(1.54、2.62)、(1.39、1.93)，相对逆转倍数分别为(73.00%、94.87%)、(41.70%、72.71%)、(29.40%、50.63%)。
| Group | IC50 (RI) | ||
| MX/nmol·L-1 | DDP/nmol·L-1 | 5-FU/nmol·L-1 | |
| MCF-7 | 9.1±1.6 | 471.8±25.9 | 258.6±3.7 |
| MCF-7/MX | 639.5±18.8(70.5)** | 3 153.4±109.5(6.7)** | 5 550.6±156.6(21.5)** |
| MCF-7/MX + baicalein (2.5 μmol·L-1) | 179.3±20.6(19.8)## | 2 035.2±79.5(4.3)## | 3 995.0±262.1(15.5)## |
| MCF-7/MX + baicalein(5 μmol·L-1) | 41.4±0.9(4.6)##△△ | 1 203.6±82.9(2.6)##△△ | 2 871.4±130.9(11.1)##△△ |
| IC50 values (x±s) represent the mean of three independent experiments. RI: resistance index (x-fold compared to that of MCF-7 cells). **P < 0.01 vs MCF-7 cells; ##P < 0.01 vs MCF-7/MX cells; △△P < 0.01 vs MCF-7/MX plus 2.5 μmol·L-1 baicalein-treated group. | |||
如Fig 3所示，2.5、5 μmol·L-1的黄芩素作用于MCF-7/MX细胞72 h后，明显抑制其BCRP的蛋白表达，差异有统计学意义(P < 0.01)，且5 μmol·L-1黄芩素组BCRP降低较2.5 μmol·L-1组更明显(P < 0.05)。
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| Fig 3 Effect of baicalein on expression of BCRP by Western blot (x±s, n=3) 1: MCF-7 group; 2: MCF-7/MX group; 3: MCF-7/MX+baicalein (2.5 μmol·L-1) group; 4: MCF-7/MX+baicalein (5 μmol·L-1) group. **P < 0.01 vs MCF-7 group; ##P < 0.01 vs MCF-7/MX group; △P < 0.05 vs MCF-7/MX plus 2.5 μmol·L-1 baicalein-treated group. |
如Fig 4所示，相对于MCF-7细胞，MCF-7/MX细胞p38磷酸化增强，NF-κB p65蛋白表达水平增高。2.5、5 μmol·L-1的黄芩素可减弱MCF-7/MX细胞p38磷酸化，减少NF-κB p65蛋白表达，差异有统计学意义(P < 0.01)，且5 μmol·L-1黄芩素组较2.5 μmol·L-1组作用更明显(P < 0.05)。
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| Fig 4 Expressions of p-p38 (A) and NF-κB p65 (B) in different groups by Western blot (x±s, n=3) 1: MCF-7 group; 2: MCF-7/MX group; 3: MCF-7/MX+baicalein (2.5 μmol·L-1) group; 4: MCF-7/MX+baicalein (5 μmol·L-1) group. **P < 0.01 vs MCF-7 group; ##P < 0.01 vs MCF-7/MX group; △P < 0.05 vs MCF-7/MX plus 2.5 μmol·L-1 baicalein-treated group. |
药物外排系统的改变是肿瘤耐药机制中最常见的一种，其中ABC转运蛋白表达增强会使药物浓度低于作用浓度，引起肿瘤耐药[5]。BCRP是ABC转运蛋白G亚家族成员，在药物的吸收、分布、消除及获得性耐药方面发挥着重要作用[6]。BCRP可特异性地泵出多种化疗药物，如米托蒽醌、拓扑替康、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)等，降低其化疗效果。肿瘤干细胞对多种化疗药物高度耐药，是癌症复发和转移的重要因素[7]。BCRP在肿瘤干细胞中高表达，严重阻碍化疗成功[8]。因此，BCRP已成为治疗多药耐药肿瘤以及根除肿瘤干细胞的重要靶点。
作为中药黄芩的有效成分之一，黄芩素已被证实可通过降低p-gp药物外排功能、增加细胞内药物浓度，逆转卵巢癌细胞的耐药[9]；通过抑制糖酵解和PTEN/Akt/HIF-1α信号通路，逆转胃癌的耐药[10]；还可通过增强缝隙连接，增强顺铂细胞毒性，提高化疗效果[11]。本研究结果证明，黄芩素(2.5、5 μmol·L-1)可增强MCF-7/MX细胞对MX、DDP、5-FU的敏感性，下调BCRP表达，逆转BCRP介导的乳腺癌细胞MDR。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是一组重要的丝/苏氨酸蛋白激酶，可以调节多种细胞活动，包括细胞增殖、分化、凋亡或存活、炎症、先天免疫等[12]。研究表明，BCRP的蛋白表达上调与p38 MAPK信号通路的激活有密切关系[13]。本实验也证实，与MCF-7细胞相比，MCF-7/MX细胞的p38磷酸化增强。黄芩素(2.5、5 μmol·L-1)可抑制MCF-7/MX细胞p38的磷酸化。因此，黄芩素下调BCRP表达，可能与其抑制p38 MAPK信号通路有关。
NF-κB在介导肿瘤放、化疗耐受的分子机制中处于核心位置。多种信号分子和信号通路，如GSK-3β、p38、PI3K等可影响NF-κB转录活性或其上游信号转导通路，参与调节免疫、生长、炎症、肿瘤及凋亡等过程[14]。有文献表明，在BCRP高表达的耐药细胞中，NF-κB信号通路被明显激活，抑制NF-κB信号通路可以逆转肿瘤细胞的MDR[15]。本实验结果也证实，与MCF-7细胞相比，MCF-7/MX细胞的NF-κB p65蛋白表达升高，黄芩素能降低NF-κB p65的蛋白表达。因此，黄芩素下调BCRP表达，可能与其抑制NF-κB信号通路也有关。
综上所述，黄芩素可通过抑制p38 MAPK通路和NF-κB信号通路，下调BCRP蛋白表达，有效逆转人乳腺癌耐药株MCF-7/MX细胞的MDR，但其具体作用靶点尚不清楚，还需进一步研究。黄芩素是一种极具开发价值的耐药逆转制剂，本研究为黄芩素在逆转MDR的临床应用提供了理论支撑，为耐药乳腺癌的成功治疗提供了实验依据。
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