短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack, TIA)是由于颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性血液供应不足，致使产生了神经系统的功能障碍，一般持续时间少于24 h。多数情况下，缺血后再灌注可使器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复；但有时缺血后再灌注不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。近年大量研究表明，脑缺血后由于恢复供氧产生自由基和炎性反应等原因引发再灌注损伤，最终导致神经细胞损伤，凋亡、最终坏死。其中，线粒体是I/R损伤的最关键环节，自由基连锁反应是脑I/R损伤的核心环节，而细胞内钙超载则可能是导致神经元死亡的最后通路[1]。线粒体是一种高度动态的管状网络细胞器，可通过频繁的融合分裂形成网状结构，并通过与细胞骨架的相互连接来维持其正常功能与形态，这种动态的变化称为线粒体分裂融合(mitochondrial fission and fusion)，也称为线粒体动力学[2-3]。近年大量研究发现，线粒体动力学紊乱可以致多种疾病发生，如神经降解性疾病、肥胖、糖尿病、癌症等[4]。因此，探讨脑I/R后线粒体分裂融合的变化以及寻找干预手段，抑制线粒体分裂融合失衡，减轻其导致的二次损伤，对脑I/R后的治疗具有重要意义。西红花(saffron，拉丁名Crocus sativus L.)别名藏红花、番红花，是鸢尾科番红花属的多年生花卉，药用部位为花的干燥柱头。西红花是我国传统中药材，也是一种常见的香料。其主要分布于南欧、伊朗等地，我国有少量栽培。传统中医药认为西红花具有疏经活络、通经化淤、散郁开结、消肿止痛的功效，主要用于治疗忧思郁结、胸膈痞闷、月经不调、产后瘀血、跌打损伤等。现代药理学研究证明，西红花可以明显提高大鼠空间认知能力[5]，并且能有效抑制G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)的转运，限制降低细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)的磷酸化[6]，从而抑制脑缺血造成的大鼠脑部损伤。因此，本研究探索大鼠脑I/R后线粒体形态的改变及线粒体分裂融合的异常，并从抑制线粒体动力学异常的角度，探讨西红花提取物治疗脑I/R、改善记忆障碍的可能机制，对相关中药治疗脑缺血疾病具有借鉴意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SD大鼠，♂，体质量(190~210) g，购自维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。
1.1.2 试剂BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液(强)、PMSF，均购自碧云天生物技术公司；动力蛋白相关GTP酶1(dynamin-like protein GTPase1, Drp1)抗体、COXIV抗体购自CST公司；视神经萎缩蛋白(optical atrophy-1，Opa1)抗体购自Santa Cruz公司；线粒体/胞质制备试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；蛋白Marker、ECL发光液购自Thermo公司；西红花总提取物由神威药业集团提供并鉴定，其中西红花总苷含量达51.5%，批号090914；金纳多(银杏叶提取物片)由德国威玛舒培博士药厂生产，批号1650711。
1.1.3 仪器Sh1倒置显微镜(Olympus)；SYNERGYTM 4酶标仪(BioTek)；IEC低温冷冻离心机(美国Thermo公司)；奥豪斯AR2130型电子天平(美国OHAUS公司)。
1.2 方法 1.2.1 分组及给药40只大鼠，随机分为4组：模型组、假手术组、西红花提取物组(3 mg·kg-1)、金纳多组(28.8 mg·kg-1)，给药体积2 mL·kg-1，于MCAO术后十二指肠给药。
1.2.2 大鼠局灶性脑I/R损伤模型(栓线法)的制备大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手术当天，大鼠3.5%的水合氯醛(0.1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，颈部备毛、消毒，做正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，插入一端加热成光滑球形并涂多聚赖氨酸的尼龙线(直径为0.25 mm)，插入深度为(18 ± 1)mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，留线，缝合皮肤，同时经大鼠十二指肠给予相应的药物。1.5 h后，轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注，造模完成。模型成功的标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Horner's征及对侧前肢为主的偏瘫，术后回笼饲养。在缺血1 h和再灌注1 h内注意维持大鼠的体温在36.5~37.5 ℃。
1.2.3 神经功能缺陷评分按照随机盲法原则对实验大鼠进行2次评分，大鼠脑I/R术后清醒2 h，进行第1次评分；再灌注24 h后进行第2次评分。参照Longa等5分制评分标准，0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全伸展左前肢；2分：动物左侧肢体瘫痪，行走时向左侧转圈，出现追尾现象；3分：动物行走向左侧跌倒，或动物不能站立或打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1~3分为造模成功。除假手术组外，各组0分(模型不成功)和4分(损伤过于严重，24 h内死亡)予以剔除，在后续试验中补充剔除组的动物，以保证每组的动物数。
1.2.4 透射电镜检查MCAO手术后24 h，大鼠3.5%的水合氯醛(0.1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，鼠左心室灌注生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛，开颅取脑，于皮层距缺血中心外侧缘1 mm处取一小块组织，大小约1 mm3。戊二醛固定，1%锇酸后固定，系列丙酮脱水，环氧树脂原位包埋，超薄(厚60 nm)切片，双铅染色，电镜观察照相。
1.2.5 常规HE染色大鼠3.5%的水合氯醛(0.1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，鼠左心室灌注生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛，开颅取脑，在固定液中固定24~48 h，脱水、透明、包埋、切片，进行常规HE染色。
1.2.6 免疫荧光检测神经元、星形胶质细胞形态大鼠接3.5%的水合氯醛(0.1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，鼠左心室灌注生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛，开颅取脑，在固定液中固定24~48 h，脱水、透明、包埋、切片、脱蜡，封闭30 min，孵育目的蛋白，制好的切片4℃保存，在激光共聚焦显微镜下观察。
1.2.7 Western blot检测蛋白水平MCAO手术后24 h，大鼠3.5%水合氯醛(0.1 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，断头处死大鼠。于皮层、海马齿状回和纹状体距缺血中心外侧缘1 mm处取材，提取的脑组织按线粒体/胞质制备试剂盒说明书提取线粒体，裂解线粒体后BCA法测定蛋白含量，并定质量浓度至10 mg·L-1，进行蛋白表达检测。蛋白含量测定后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用相关抗体进行Western blot检测。
1.2.8 统计学分析计量数据以x±s表示，采用SPSS进行数据处理，Western blot图像分析进行非参数检验。
2 结果 2.1 西红花对大鼠局灶性脑I/R后2、24 h神经行为学评分的影响与模型组比较，西红花提取物可明显降低I/R大鼠神经行为评分的分值，见Tab 1。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Score(2 h) | Score(24 h) |
| Sham | - | 0±0** | 0±0** |
| Model | - | 2.9±0.32 | 2.9±0.47 |
| Saffron | 3 | 2.6±0.51* | 2.4±0.69* |
| Ginaton | 28.8 | 2.5±0.53 | 2.1±0.73** |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | |||
如Fig 1所示，正常组镜下可观察到大量线粒体，双层膜结构完整，线粒体嵴正常排列；模型组大鼠线粒体病变严重，线粒体肿胀，双层膜结构缺失，线粒体嵴断裂，细胞器数量减少。西红花可有效减轻I/R引起的线粒体形态破坏，减轻神经元水肿损伤，线粒体内外膜机构较完整，线粒体肿胀及空泡状改变减轻; 线粒体嵴的数目和形态趋于正常。
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| Fig 1 Ultrastructural morphology of mitochondria A:Sham group(× 30 000); B:MCAO group (×50 000); C:Saffron crocus 3 mg·kg-1 group(×50 000); D:Ginaton 28.8 mg·kg-1 group(×50 000) |
如Fig 2所示，假手术组大鼠皮层未见明显病理改变，神经元细胞结构正常，细胞排列层次分明，结构完整、胞质丰富；模型组皮层神经元细胞排列紊乱，细胞坏死，细胞核固缩深，着色变浅，神经元数目明显减少。西红花组较模型组病变减轻，皮层神经元少量变性，减轻核固缩和核溶解程度，抑制神经元的凋亡与坏死，较为明显改善脑I/R损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤。
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| Fig 2 Effect of saffron crocus on pathomorphologyof cerebral tissues in rats(×20) A:Sham group; B:MCAO group; C:Saffron crocus 3 mg·kg-1 group; D:Ginaton 28.8 mg·kg-1 group |
如Fig 3所示，正常组神经元细胞结果正常(MAP2绿色荧光)，星形胶质细胞形态正常(GFAP红色荧光)，而模型组可见神经元荧光强度降低，而星形胶质细胞大量增生，呈瘢痕状；与模型组比较，西红花3 mg·kg-1能明显抑制神经元坏死，抑制星形胶质细胞增生。
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| Fig 3 Effect of saffron crocus on neurons, astrocytes in I/R rats(×20) |
缺血90 min/再灌注第24 h，以COV Ⅳ作为线粒体内参，发现在缺血周边半暗带的皮层Drp1表达明显升高，Opa1表达降低，西红花可有效下调Drp1表达，上调Opa1表达(P < 0.01, P < 0.05)，见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of crocin on expressions of Drp1, Opa1 in brain of rats induced by MCAO(x±s, n=3) A:Protein levels of Drp1 and Opa1; B:Protein levels quantified by band gray-value ratio to COX Ⅳ. **P < 0.01 vs sham; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MCAO. |
线粒体融合分裂的动态平衡是神经元末梢长距离运输和能量平均分布的基本保证[7-8]，在神经元内，突触和树突棘的形成与线粒体融合分裂的动态调节过程密切相关。线粒体不断的融合分裂，从而控制细胞器的大小，有利于介导线粒体将能量运输至高度分化神经元远距离的树突棘和轴突延伸区域。这种机制能确保高耗能区域有充足的ATP供应，并对ATP能进行合理的分配。然而，线粒体动力学异常使线粒体在神经元中的运输受阻，线粒体分布紊乱，从而导致线粒体能量代谢效率降低和活性氧(reactive oxygen species，ROS)产量增加等。以上揭示了线粒体融合分裂异常可能是多数神经变性疾病的致病机制之一。
在哺乳动物中，线粒体的动态变化受多个线粒体融合分裂相关蛋白控制。在线粒体融合的过程中，定位于线粒体外膜和内膜的3种动力学相关GTP酶发挥了重要作用，即线粒体融合蛋白1(mitofusin1，Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)和Opa1。其中，线粒体外膜的融合依赖两种线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2，其主要功能是促进线粒体外膜的融合[9]。Mfn1、Mfn2的缺陷会导致线粒体融合障碍、出现大量碎片状线粒体。线粒体内膜的融合由Opa1介导，除了参与线粒体融合的控制以外，Opa1对于线粒体嵴结构的维持非常重要，Opa1的缺失可导致线粒体嵴重构，引起细胞色素C释放[10]。线粒体分裂指线粒体一分为二的过程，许多小分子蛋白质参与这一过程。其中，Drp1和分裂蛋白1(fission 1, Fis1)主要参与调控。Drp1存在于胞质中，而Fis1是一种定位在线粒体外膜的蛋白，主要作为一个受体负责招募Drp1到线粒体上，形成环状结构，逐渐收缩致使线粒体分裂。实验证实，Drp1基因高表达时可以加速线粒体的分裂，继而产生大量碎片化的线粒体。线粒体的融合分裂与细胞的代谢、增殖、凋亡、自噬等各种功能密切相关。研究发现，抑制线粒体融合可导致线粒体断裂，促使细胞凋亡。如Sugioka等[11]发现，下调HeLa细胞中Mfn1和Mfn2的表达，抑制了线粒体融合，出现线粒体断裂，增加细胞对凋亡刺激的敏感性; 而过表达Mfn1和Mfn2在引起线粒体融合的同时，延缓了细胞凋亡。线粒体分裂后，膜电位相对高的子线粒体发生融合，而膜电位相对低的子线粒体发生自噬，因此，线粒体融合可使蛋白相互补充，代谢物均匀分配，突变DNA得以修复，保持细胞内线粒体的完整性和同质性[12]。而线粒体过度分裂致线粒体碎片化是细胞凋亡的标志阶段，线粒体的碎片化导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C从线粒体释放，激活caspase酶，从而促发凋亡[13]。本研究证实，大鼠脑I/R后，线粒体正常形态破坏，大脑皮层线粒体Drp1表达上升，Opa1表达下降，线粒体分裂融合失衡，因此，线粒体动力学异常可能是缺血性脑血管病的发病机制之一，并可能进一步导致神经元的凋亡与坏死。
目前已有研究报道发现，西红花苷可降低脑I/R后脑梗死面积，并对神经元具有保护作用[14-15]，且能明显降低缺血皮层丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，提高谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。从本研究可以看出，西红花提取物可有效抑制大鼠脑缺血后神经元死亡，抑制星形胶质细胞过度增殖；进一步实验观察到，西红花可以有效下调Drp1表达，上调Opa1表达。以上实验证实了西红花能改善脑缺血损伤导致的能量代谢异常，而其改善能量代谢的途径可能是改善线粒体动力学异常，恢复线粒体正常的融合分裂。越来越多的研究证明，在许多神经系统疾病中，都存在线粒体融合分裂异常的情况，这提示了线粒体动力学异常可能是神经变性疾病的致病机制之一。因此，进一步探索脑缺血后线粒体分裂融合的变化及设立时间点寻找其变化规律，寻找相关药物作用靶点，对于防治缺血性脑血管病、促进脑缺血后神经发生及记忆的恢复具有一定意义。
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