2. 南京中医药大学 江苏省中药功效物质重点实验室，江苏 南京 210023;
3. 南京中医药大学 中药品质与效能国家重点实验室(培育)，江苏 南京 210023
2. Jiangsu Key Lab of Functional Substance of Chinese Medicine;
3. State Key Lab Cultivation Base for TCM Quality and Efficacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生与发展是一个复杂的病理和细胞生化过程。这一过程受到多种细胞因子以及细胞内信号通路网络的调控[1-2]。近年来，随着许多新策略与新技术在HCC领域的不断运用，在这个复杂的调控网络中呈现出许多新的成员[1-3]，深入挖掘这些潜在靶点的药理学特性以及作用机制，将对阐明HCC发生机制以及后续的基于靶点的药物设计发挥重要作用。近年来，临床与基础研究均表明，铁死亡(ferroptosis)在HCC的发生、发展中扮演着重要的角色[4-5]，被认为是HCC治疗的潜在靶点。铁死亡是新近发现的一种铁依赖性细胞死亡方式，主要由脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4, Gpx4)失活以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)特别是脂质ROS聚集诱导发生[4-6]。现已证实，System XC-和Gpx4信号通路[7]、p62-Keap1-Nrf2信号通路[8]、p53信号通路[9]、Rb信号通路[10]、CISD1信号通路[11]以及MT1G信号通路[12]与铁死亡的调控存在密切的联系，进而在HCC的发生、发展中起到重要作用。本文就近年来这方面的研究进展，论述铁死亡在防治HCC中的重要作用。
1 铁死亡概述2012年，Dixon等[5]首次发现并报道了一种新型的细胞死亡方式——铁死亡。铁死亡是一种铁离子依赖性的氧化死亡方式，主要表现为过度的氧化应激以及膜脂质过氧化反应，最终导致质膜选择透过性损坏，从而造成细胞死亡。
铁死亡作为一种全新的细胞死亡模式，在诱导因素、形态特征、调控通路以及诱导剂、抑制剂等方面明显区别于凋亡[13]、坏死[14]、自噬[15] (Tab 1)。铁死亡发生的主要原因是谷胱甘肽(glutathione, GSH)合成减少以及Gpx4活性抑制，其形态学特征是质膜起泡、线粒体变小、线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少或消失、细胞质以及脂质ROS增多、细胞核正常，主要涉及的调控通路包括System XC-和Gpx4信号通路、MVA信号通路、HSF1-HSPB1信号通路[4]。
| Cell death | Morphological features | Inducing factors | Regulatory pathways | Inducers | Inhibitors |
| Ferroptosis | Cell membrane: lack of rupture and blebbing of the plasma membrane; rounding-up of the cell Cytoplasm: small mitochondria with condensed mitochondrial membrane densities, reduction or vanishing of mitochondria crista, as well as outer mitochondrial membrane rupture Nucleus: normal nuclear size and lack of chromatin condensation[5] | Inhibition of GSH synthesis and GPx4 activity result in excessive lipid peroxides | System Xc- and Gpx4 signal pathway; MVA signal pathway; HSF1-HSPB1 signal pathway[6-7] | System Xc- inhibitors: erastin, erastin derivatives (MEII, PE, AE), DPI2, BSO, SAS, Lanperisone, SRS13-45, SRS13-60; Gpx4 inhibitors: RSL3, DPI7, DPI10, DPI12, DPI13, DPI17, DPI18, DPI19, ML160 Drugs: sorafenib, artemisinin derivatives [4-7] | Iron chelators: desferoxamine, solamine, 2, 2-Bipyridyl; Anti-oxidants: vitamin E, U0126, Trolox; ROS formation inhibitors: ferrostatin-1, SRS8-24, SRS8-72, SRS11-92, SRS12-45, SRS13-35, SRS13-37, SRS16-86, CA-1; Others:cycloheximide, amino-Oxyacetic acid, ebselen, β-mercaptoethanol[4-7] |
| Apoptosis | Cell membrane: plasma membrane blebbing; rounding-up of the cell Cytoplasm: retraction of pseudopods; reduction of cellular volume Nucleus: reduction of nuclear volume; nuclear fragmentation; chromatin condensation[13] | Activation of Caspase-3 and endonuclease | Death receptor pathway; Mitochondrial pathway; Endoplasmic reticulum pathway | Extrinsic apoptosis: FASL, DCC, UNC5B; Intrinsic apoptosis: multiple intracellular stress conditions (e.g. DNA damage, cytosolic Ca2+ overload) [13] | Caspase inhibitor：Z-VAD-FMK[13] |
| Necroptosis | Cell membrane: rupture of plasma membrane Cytoplasm: cytoplasmic swelling (oncosis); swelling of cytoplasmic organelles Nucleus: moderate chromatin condensation[14] | Phosphorylation and oligomerization of MLKL proteins which embedd and infiltrate into the plasma membrane | TNF mediated signal pathway, TLR3 mediated signaling pathway | TNF-α; zVAD-fmk; PAMPS | Necrostatin-1; NecrosulfonaMide; Kongensin A |
| Autophagy | Cell membrane: unchange Cytoplasm: accumulation of double-membraned autophagic vacuoles Nucleus: lack of chromatin condensation[15] | Inhibition of mTOR; Increasing of autophagy related factors(e.g. Atgs, LC3) | PI3K-AKT-mTOR signal pathway; MAPK-ERK1/2-mTOR signal pathway[15] | IMPase inhibitor：Lithium chloride; making starvation: earle's balanced salt solution; Class Ⅰ PI3K pathway inhibitor : C2-ceramide; mTOR inhibitor: Rapamycin | Class Ⅲ PI3K inhibitor：3-MA; Proton pump inhibitor：Bafilomycin A1; Lysosomal cavity alkalization agent：Hydroxychloroquine |
目前研究表明，铁死亡主要受System XC-[7]以及Gpx4[6-7]调节。具体调节机制如下：(1)System XC-[7]是细胞表面的异二聚体-谷氨酸/胱氨酸转运体，主要作用是实现胞内谷氨酸与胞外胱氨酸相互置换，因此，选择性抑制System XC-将造成细胞内GSH合成前体——胱氨酸吸收减少，以致GSH(细胞内主要的抗氧化剂)合成减少，从而导致毒性脂质ROS过度堆积，诱导细胞死亡；(2)Gpx4[6-7]是清除脂氧自由基所必需的酶，它可以减少毒性脂质过氧化物(L-OOH)的含量，并将其转化成无毒脂醇(L-OH)，而Gpx4一旦失活，L-OOHs会逐渐积聚，与此同时细胞内铁发挥催化作用，将L-OOHs催化成脂质自由基(L-O·)，产生细胞毒性，导致细胞死亡。
虽然铁死亡的生理功能尚不明确，但它与多种生理和病理过程相关，包括肿瘤细胞死亡、神经退行性疾病、急性肾功能衰竭、药物肝毒性、肝和心脏缺血/再灌注损伤以及T细胞死亡等[4-12]。然而，与癌症(如HCC、胰腺癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌等)的联系更加密切，主要是由于肿瘤细胞铁离子的含量比正常细胞高，而且高表达致癌基因RAS，使得肿瘤细胞对于铁死亡更加敏感。所以，诱导铁死亡可能成为防治肿瘤的新策略。
2 铁死亡与HCCHCC是我国乃至全世界常见的恶性肿瘤之一，其主要特征表现为癌细胞保留部分肝细胞的特征，不形成肝小叶；而且呈多角形，胞质丰富，核大而核仁明显，分化较好者可在胞质中见到胆汁粒；癌细胞常排列成巢状或索状，癌巢间有丰富血窦。HCC可由多种病因引起，其中肝炎病毒以及肝硬化是其重要的致病因素[17]。近年来，铁死亡在HCC的发生、发展中的作用引起大量学者的关注，逐渐成为肝癌领域研究的热点[4-12]。与正常生理状态肝细胞相比，HCC细胞中RAS致癌基因的高表达、铁离子含量增加，所以HCC细胞对铁死亡更加敏感，这提示铁死亡在HCC的发生、发展中扮演着重要角色。本文接下来将针对铁死亡在HCC中的分子机制作重点阐述(Fig 1)。
|
| Fig 1 Related regulatory pathways of ferroptosis in HCC |
近年来，大量的临床数据以及实验研究显示，Keap1-Nrf2-ARE信号通路与HCC发展进程存在密切的联系[8, 17-19]。Gum等[17]利用对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)介导的药物性肝损伤模型进行研究，发现Keap1-Nrf2-ARE通路激活能减少肝损伤时ROS以及脂质过氧化物的产生，提示Keap1-Nrf2-ARE信号通路可能与相关肝脏疾病存在密切的关系。Bishayee等[18]发现，同时采用致癌致突变衍生物2-氨基-3-甲基咪唑[4, 5-9]喹啉处理裸鼠和Nrf2缺陷鼠时，Nrf2缺陷鼠肝癌发生率明显高于野生型小鼠，说明Keap1-Nrf2-ARE信号通路在肝癌发生中发挥重要作用。Sid等[19]也得到了类似结果，发现实验采用的药物5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside, AICAR)可以通过诱导Nrf2基因表达，从而调节HCC细胞的氧化还原状态，发挥减轻肝细胞损伤的作用，但一旦将Nrf2基因沉默则会解除AICAR的保肝作用。这些报道显示，在HCC中，Keap1-Nrf2-ARE信号通路可以调节下游相关因子的表达，从而调控HCC的发展。
近年的研究发现，p62-Keap1-Nrf2信号通路对HCC的影响与铁死亡存在紧密的联系。Sun等[8]报道，干扰p62表达会增强爱拉斯汀(erastin)/索拉非尼诱导的HCC细胞铁死亡；此外，在Nrf2 shRNA HCC细胞肿瘤移植小鼠以及Nrf2 shRNA HCC细胞实验中，Nrf2敲低可以增强爱拉斯汀/索拉非尼抗HCC的作用。这些结果表明，在爱拉斯汀/索拉非尼诱导的HCC细胞铁死亡中，p62-Keap1-Nrf2信号通路扮演着重要角色。总结p62-Keap1-Nrf2对HCC过程中铁死亡的具体调节机制为[8]：在细胞正常状态下，Nrf2与Keap1特异性结合于细胞质中，此时Nrf2的活性受到抑制，细胞处于稳定状态。但当细胞损伤癌变时，p62可以通过使Keap1失活，从而防止Nrf2降解，促进其激活、转位、入核。入核的Nrf2与Maf蛋白等形成二聚体，并与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)结合，从而激活下游调节铁和ROS代谢相关基因的表达，包括醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain1, FTH1)等，由于铁死亡主要表征为铁依赖性脂质过氧化物的聚集，而这些基因的表达能阻止铁死亡的发生。总之，p62-Keap1-Nrf2主要对其下游的铁和ROS代谢相关基因的表达进行调节，从而调控铁死亡的发生，进而影响HCC的发生、发展。
2.2 p53信号通路调控铁死亡p53是一种肿瘤抑制基因，抑癌基因p53的突变失活是肝细胞生物学特性发生改变的核心分子事件。正常情况下，p53能够介导相关信号转导，从而调控细胞的生长、分化、凋亡等过程，达到维持细胞基因稳定性的目的。而在肝脏损伤癌变时，p53基因会发生突变，突变型的p53蛋白会在肝癌组织中堆积，通过与野生型p53的杂合型聚合，或反而获得原癌基因激活功能，使野生型p53基因诱导凋亡、阻滞细胞周期及DNA修复功能受损，导致凋亡逃逸和细胞的过度增殖，最终加剧HCC的发生、发展。
最新的研究表明，p53可能可通过调控铁死亡来影响HCC的发展进程[9, 20-23]。p53在HCC细胞体系中可以诱导铁死亡的发生，p53调控铁死亡的具体机制可以归纳为3条重要途径：① Jiang等[9]报道，p53可以通过5'端的p53反应元件抑制SLC7A11转录，增强铁死亡，而其中SLC7A11是System XC-组成亚单位之一，它调节的胱氨酸摄取是生物体合成GSH的限速步骤，一旦SLC7A11受抑制，会造成GSH合成减少以及ROS产生增加，从而诱导铁死亡发生[20]；② Ou等[21]报道，p53可以直接靶向基因SAT1，增加SAT1的表达，从而升高花生四烯酸15脂氧合酶(15-lipoxygenase，ALOX15)的水平，最终加剧脂质过氧化，导致铁死亡发生；③ Gao等[22]发现，谷氨酰胺在铁死亡中发挥重要作用，所以他们认为GLS2作为p53调控的谷氨酰胺酶，对于铁死亡的调节是必需的。之后，Jennis等[23]报道，在p53基因突变的人类和小鼠细胞中GLS2不能被激活，对铁死亡不敏感。总之，在HCC发生过程中，p53突变可以通过抑制铁死亡的发生，加剧HCC的发生、发展。
2.3 Rb信号通路调控铁死亡在HCC发生、发展时，会有许多相关基因/蛋白表达以及通路异常，而最常发生的是Rb肿瘤抑制通路异常。Rb蛋白是调节真核细胞多种基因转录功能的蛋白家族成员之一，它主要作为细胞增殖、细胞周期进程的负性调节因子。
目前临床数据表明，肝炎病毒感染导致的HCC患者肝脏样本中Rb蛋白水平是降低的[24]；体内研究方面，小鼠模型实验揭示Rb功能的失效可以直接促进肝癌的发生，这些都证明Rb蛋白在HCC发展过程中至关重要[25]。体外研究方面，Louandre等[10]研究证实，与未进行索拉非尼处理的HCC细胞相比，使用索拉非尼处理过的HCC细胞Rb表达量明显降低，而且死亡率是未处理组的2~3倍；接着，他们采用HCC细胞肿瘤移植小鼠的体内实验以及shRb Huh7细胞的体外实验，阐明了Rb是如何调节索拉非尼诱导的HCC细胞铁死亡的。索拉非尼能够诱导HCC细胞铁死亡的主要原因是增加线粒体ROS产生，而Rb失活会增加线粒体ROS，增强氧化应激，从而加剧铁死亡。总之，这些结果说明，Rb蛋白在调节HCC细胞的铁死亡中起着至关重要的作用，但是其具体的分子机制有待进一步探索研究。
2.4 CISD1信号通路调控铁死亡近年来有实验研究显示，CDGSH铁硫域1(CISD1，也称为mitoNEET)在HCC的发生、发展中扮演着重要的角色[11]。CISD1广泛表达于线粒体丰富的组织(如肝脏和心脏)，是一种含铁线粒体膜外蛋白[11]，能够功能性调节线粒体铁的吸收，以及呼吸能力。CISD1与肝癌的发展是密切相关的，一旦缺失会造成线粒体内铁的积累以及随后发生的氧化损伤。这些结果显示，CISD1在HCC细胞线粒体铁代谢中发挥重要作用。
Yuan等[11]最新的研究结果表明，CISD1可能是通过调控铁死亡，对HCC的发生、发展产生影响。他们采用经典铁死亡诱导剂爱拉斯汀处理人类HCC细胞(如HepG2、Hep3B)，发现能够铁依赖性地促进CISD1表达；通过基因学手段(CISD1 shRNA)抑制CISD1的表达，结果显示HCC细胞中铁介导的线粒体脂质过氧化会增加，加剧爱拉斯汀诱导的铁死亡；与此相反，采用CISD1的铁硫簇稳定剂吡格列酮处理HCC细胞，结果显示吡格列酮可以抑制线粒体铁的吸收、脂质过氧化以及随后发生的铁死亡。这些结果表明，CISD1在HCC发生、发展过程中可以通过防止线粒体损伤，从而对铁死亡产生负调节作用。其中，CISD1调控铁死亡的机制主要是CISD1可以减少线粒体铁离子聚集，CISD1缺失则会导致线粒体铁超载，铁离子会介导芬顿反应产生脂质过氧化物，从而诱导铁死亡的发生。总之，在HCC发生、发展过程中，可以通过靶向抑制CISD1的表达来增强细胞线粒体脂质过氧化，从而诱导铁死亡发生，最终调控HCC的发展进程。
除了上述提及的调控HCC中铁死亡的分子机制，最近Houessinon等[12]研究显示，金属硫蛋白-1 (metallothionein-1，MT1)可以作为索拉非尼(铁死亡诱导剂)处理HCC细胞后氧化还原代谢改变的生物标志物，并且鉴定索拉非尼作用于含有133碱基对的区域，该区域位于MT1G启动子转录起始位点上游。更有趣的是，MT1G启动子区域含有Nrf2识别的ARE结构，于是，他们进一步采用Nrf2 siRNA技术干扰Huh7细胞中Nrf2的表达，结果显示Nrf2 siRNA可以明显抑制索拉非尼对MT1G的诱导作用。这些数据结果表明，在HCC发展进程中，调节MT1G的表达可以对铁死亡产生调控作用，而且这一作用的产生与Nrf2的表达密切相关。
3 总结铁死亡作为一种新的细胞死亡方式，与多种生理和病理过程相关，包括肿瘤细胞死亡、急性肾功能衰竭、药物肝毒性、肝和心脏缺血/再灌注损伤等，所以在相关疾病的预防和治疗中具有重要意义。尽管如今有越来越多针对铁死亡在HCC进程中诱导机制和信号通路的研究，但是仍然存在许多问题。目前关于铁死亡在HCC进程中的研究主要集中于System XC-和Gpx4相关信号通路，但铁离子以及其铁离子代谢相关通路、ROS代谢相关通路在铁死亡中的作用尚未被具体阐述，所以针对这些亟待解决的问题，我们需要进行深入的研究。总之，铁死亡可能为HCC治疗提供新的策略。
| [1] | Hirokawa F, Hayashi M, Asakuma M, et al. Risk factors and patterns of early recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol, 2016, 25(1): 24-9. doi:10.1016/j.suronc.2015.12.002 |
| [2] | Shang R Z, Qu S B, Wang D S. Reprogramming of glucose metabolism in hepatocellular carcinoma: progress and prospects[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(45): 9933-43. doi:10.3748/wjg.v22.i45.9933 |
| [3] | 张自力, 赵士峰, 许文萱, 等. 细胞因子信号转导抑制分子-3在肝纤维化中的作用及研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(12): 1646-51. Zhang Z L, Zhao S F, Xu W X, et al. The role and progress of cytokine signal transduction inhibitor -3 in liver fibrosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(12): 1646-51. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.005 |
| [4] | Xie Y, Hou W, Song X, et al. Ferroptosis: process and function[J]. Cell Death Differ, 2016, 23(3): 369-79. doi:10.1038/cdd.2015.158 |
| [5] | Dixon S J, Lemberg K M, Lamprecht M R, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death[J]. Cell, 2012, 149(5): 1060-72. doi:10.1016/j.cell.2012.03.042 |
| [6] | Yang W S, SriRamaratnam R, Welsch M E, et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[J]. Cell, 2014, 156: 317-31. doi:10.1016/j.cell.2013.12.010 |
| [7] | Cao J Y, Dixon S J. Mechanisms of ferroptosis[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73: 2195-209. doi:10.1007/s00018-016-2194-1 |
| [8] | Sun X, Ou Z, Chen R, et al. Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells[J]. Hepatology, 2016, 63(1): 173-84. doi:10.1002/hep.28251 |
| [9] | Jiang L, Kon N, Li T, et al. Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression[J]. Nature, 2015, 520(7545): 57-62. doi:10.1038/nature14344 |
| [10] | Louandre C, Marcq I, Bouhlal H, et al. The retinoblastoma (Rb) protein regulates ferroptosis induced by sorafenib in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Lett, 2015, 356: 971-7. doi:10.1016/j.canlet.2014.11.014 |
| [11] | Yuan H, Li X, Zhang X, et al. CISD1 inhibits ferroptosis by protection against mitochondrial lipid peroxidation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 478(2): 838-44. doi:10.1016/j.bbrc.2016.08.034 |
| [12] | Houessinon A, François C, Sauzay C, et al. Metallothionein-1 as a biomarker of altered redox metabolism in hepatocellular carcinoma cells exposed to sorafenib[J]. Mol Cancer, 2016, 15(1): 38. doi:10.1186/s12943-016-0526-2 |
| [13] | Cao L, Quan X B, Zeng W J, et al. Mechanism of hepatocyte apoptosis[J]. J Cell Death, 2016, 9: 19-29. |
| [14] | Najafov A, Chen H, Yuan J. Necroptosis and cancer[J]. Trends Cancer, 2017, 3(4): 294-301. doi:10.1016/j.trecan.2017.03.002 |
| [15] | Galluzzi L, Baehrecke E H, Ballabio A, et al. Molecular definitions of autophagy and related processes[J]. EMBO J, 2017, 36(13): 1811-36. doi:10.15252/embj.201796697 |
| [16] | Perz J F, Armstrong G L, Farrington L A, et al. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide[J]. J Hepatol, 2006, 45(4): 529-38. doi:10.1016/j.jhep.2006.05.013 |
| [17] | Gum S I, Cho M K. Recent updates on acetaminophen hepatotoxicity: the role of Nrf2 in hepatoprotection[J]. Toxicol Res, 2013, 29: 165-72. doi:10.5487/TR.2013.29.3.165 |
| [18] | Bishayee A, Bhatia D, Thoppil R J. Pomegranate-mediated chemoprevention of experimental hepatocarcinogenesis involves Nrf2-regulated antioxidant mechanisms[J]. Carcinogenesis, 2011, 32(6): 888-96. doi:10.1093/carcin/bgr045 |
| [19] | Sid B, Glorieux C, Valenzuela M, et al. AICAR induces Nrf2 activation by an AMPK-independent mechanism in hepatocarcinoma cells[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 91(2): 168-80. doi:10.1016/j.bcp.2014.07.010 |
| [20] | Wang S J, Ou Y, Jiang L, et al. Ferroptosis: a missing puzzle piece in the p53 blueprint[J]. Mol Cell Oncol, 2015, 3(3): e1046581. |
| [21] | Ou Y, Wang S J, Li D, et al. Activation of SAT1 engages polyamine metabolism with p53-mediated ferroptotic responses[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(44): E6806-12. doi:10.1073/pnas.1607152113 |
| [22] | Gao M, Monian P, Quadri N, et al. Glutaminolysis and transferrin regulate ferroptosis[J]. Mol Cell, 2015, 59(2): 298-308. doi:10.1016/j.molcel.2015.06.011 |
| [23] | Jennis M, Kung C P, Basu S, et al. An African-specific polymorphism in the TP53 gene impairs p53 tumor suppressor function in a mouse model[J]. Genes Dev, 2016, 30(8): 918-30. doi:10.1101/gad.275891.115 |
| [24] | Munakata T, Liang Y, Kim S, et al. Hepatitis C virus induces E6AP-dependent degradation of the retinoblastoma protein[J]. PLoS Pathog, 2007, 3(9): 1335-47. |
| [25] | Mayhew C N, Carter S L, Fox S R, et al. RB loss abrogates cell cycle control and genome integrity to promote liver tumorigenesis[J]. Gastroenterology, 2007, 133(3): 976-84. doi:10.1053/j.gastro.2007.06.025 |