2. 河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治重点实验室,河北 石家庄 050200
2. Hebei Key Lab of Chinese Medicine Research on Cardio-cerebrovascular Disease, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China
神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是指一类具有向多个细胞系分化(神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞),同时又能自我更新的细胞。在神经组织损伤后,处于静止状态的NSCs可被激活、增殖,并可迁移至损伤区,取代受损的细胞,并重建神经环路来修复受损的神经组织。但内源性NSCs数量不多,而且能迁移到损伤区的内源性NSCs的数量有限[1],所以积极开展外源性NSCs移植治疗神经系统损伤和退行性疾病成为近年来研究的热点[2]。目前,外源性NSCs提取和体外培养方法均有多种,得到活力和稳定性均较高的NSCs种子细胞效果不一。因此,比较、筛选、建立一套完善、实用、可靠的NSCs提取、体外培养方法,为获得外源性NSCs提供良好的技术支持,是本研究的目的所在。
1 材料 1.1 实验动物清洁级健康SD孕鼠、乳鼠。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号为SCXK(京)2016-0011。
1.2 试剂DMEM/F12(1:1)、B-27、Accutase酶均购于Gibco公司;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)购于PeproTech公司;胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司;巢蛋白(Nestin)抗体、Cy3标记的山羊抗兔IgG,购于北京博奥森生物技术有限公司;T1350型胰蛋白酶、多聚赖氨酸,购于北京索莱宝科技有限公司;CCK-8试剂盒,购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.3 仪器3111型二氧化碳培养箱、Varioskan LUX多功能微孔板读数仪,购于Thermo;DM5000B型荧光显微镜,购于Leica;IX73型生物显微镜,购于OLYMPUS;80-2型离心机,购于江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。
2 方法 2.1 NSCs的提取NSCs的来源分为2组:胎龄14 d胎鼠和新生24 h内乳鼠,提取步骤:取孕14 d SD大鼠1只,腹腔注射10%的水合氯醛(3.5 mL·kg-1),将其浸泡于75%乙醇中30 min(仅露出头部),然后用无菌器械取出子宫,置于75%乙醇中浸泡2 min。在超净台内解剖子宫,将胎盘包裹的胎鼠置于预冷的D-Hank’s液中。逐个取出胎鼠的大脑皮质,置于含有D-Hank’s液的培养皿中,迅速用无菌镊子仔细剥离脑膜,将剥离干净的脑组织转移至含有DMEM/F12(1:1)培养基的平皿中,眼科剪剪碎,用无菌吸管转移到15 mL离心管内,轻柔吹打至肉眼无可见组织块为宜,以1000 r·min-1离心5 min,弃上清,加入NSCs无血清培养基,轻柔吹打成细胞悬液,先后过200目和500目细胞筛[3-5]。细胞计数后,调整浓度为1.0×109·L-1,接种于25 cm2培养瓶内,置37℃、5% CO2培养箱中。新生24 h内乳鼠大脑皮质NSCs提取同胎鼠NSCs提取法。原代培养4 d,观察两组神经球生成情况。
2.2 NSCs的的培养 2.2.1 培养基培养基分为2组:A组:DMEM/F12[6](97%)+B27[7](2%)+bFGF(20 μg·L-1)+EGF[8](20 μg·L-1)+青链霉素(1%)配制成的NSCs无血清培养基;B组:DMEM/F12(90%)+胎牛血清(10%)配制成的NSCs含血清培养基。提取胎龄14 d胎鼠大脑皮质的NSCs,调整细胞密度为1.0×109·L-1,接种于25 cm2培养瓶内,悬浮培养法原代培养4 d,观察两组神经球生成情况。
2.2.2 接种按细胞接种密度不同,分为3组:1.0×108·L-1组[9]、1.0×109·L-1组[4]和1.0×1010·L-1组。提取胎龄14 d胎鼠大脑皮质的NSCs后,接种于25 cm2培养瓶内,采用无血清培养基,采取悬浮培养法,原代培养2、5 d,观察各组形成神经球数量和状态。
2.2.3 培养方法按NSCs培养方法,分为悬浮培养法和贴壁培养法2组。悬浮培养法:将提取的NSCs接种于培养瓶后,不做特殊处理;贴壁培养法:用浓度为0.01%的多聚赖氨酸包被25 cm2的培养瓶,并将培养瓶置于无菌环境中,室温下过夜干燥待用。提取胎龄14 d胎鼠大脑皮质的NSCs,采用无血清培养基,以1.0×109·L-1的密度接种,原代培养3 d,观察两组神经球的形成情况。
2.2.4 换液方法提取胎龄14 d胎鼠大脑皮质的NSCs,采用无血清培养基,以1.0×109·L-1的密度接种于25 cm2培养瓶,采用悬浮培养法进行培养,按照换液方法的不同分为3组:每2~3 d全量换液组、每2~3 d半量换液组[4]、每2~3 d不弃液只加液1~1.5 mL组,原代培养7 d,观察各组所形成的神经球活力的差异。
2.2.5 传代方法按NSCs传代方法不同,分为3组:胰酶消化组[10-11]、Accutase酶消化组[12]和机械吹打组[13-14]。酶消化法操作步骤:无菌吸管将含有神经球的培养基转移至15 mL离心管,静置15 min,去除上清液,加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶,并轻柔缓慢吹打10 min,加入4 mL无血清培养基终止消化,以1 500 r·min-1离心10 min,去除上清液,加入无血清培养基,调整细胞密度为1.0×109·L-1,接种于25 cm2培养瓶内。机械吹打法操作步骤:无菌吸管将含有神经球的培养基转移至15 mL离心管,静置15 min,去除上清液,加入2 mL无血清培养基,轻柔缓慢吹打10 min,调整细胞密度为1.0×109·L-1,接种于25 cm2培养瓶内。比较采用以上3种不同传代方法传代后的NSCs状态。
2.3 NSCs的鉴定将Nestin作为NSCs鉴定的依据,对培养至3、5、7代的神经球行Nestin免疫荧光染色。鉴定步骤:吸取适量含有神经球的培养基,接种于有多聚赖氨酸包被盖玻片的12孔板内,培养4 h后,显微镜下观察神经球已经贴壁生长,PBS洗3次,每次5 min,室温下4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,每次5 min,加0.3% Trition-100室温下孵育20 min,PBS洗3次,每次5 min,用山羊血清封闭液室温下封闭30 min,吸除封闭液,滴加一抗(PBS稀释的效价为1:100兔抗鼠Nestin抗体)4℃孵育过夜,PBS洗3次,每次5 min,滴加二抗(Cy3标记的山羊抗兔IgG)室温避光孵育2 h,PBS洗3次,每次5 min,滴加DAPI染液,避光室温孵育10 min,PBS洗3次,每次5 min,用抗荧光衰减封片剂封片,于荧光显微镜下观察并采集图像。
2.4 NSCs活性的检测按鼠龄的不同和传代方法的不同,分为4组:24 h乳鼠胰酶消化组、24 h乳鼠Accutase酶消化组、14 d胎鼠胰酶消化组、14 d胎鼠Accutase酶消化组。按本文方法,分别提取新生24 h内乳鼠和胎龄14 d胎鼠大脑皮质的NSCs,采用无血清培养基,以1.0×109·L-1的密度接种于25 cm2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1~1.5 mL,每6~7 d传代1次,在37℃、5% CO2培养箱中培养至第2代d 7,用无菌吸管将含有神经球的培养基转移至15 mL离心管,静置15 min,去除上清液,分别加入0.125%胰酶1 mL或Accutase酶1 mL,并轻柔缓慢吹打10 min左右,加入4 mL无血清培养基终止消化,以1 500 r·min-1离心10 min,去除上清液,加入无血清培养基,调整细胞密度为5.0×108·L-1,分别接种于96孔板内,每组6个复孔,每孔加入100 μL细胞悬液,再向细胞悬液中加入10 μL CCK-8溶液,轻轻敲击培养板以帮助混匀,置37℃、5% CO2培养箱中培养5 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度。吸光度越高,代表NSCs活性越好。
2.5 统计学处理所有数据均以x±s表示,应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理,多组间比较采用方差齐性检验,两两比较采用Kruskal-Wallis检验。
3 结果 3.1 不同鼠龄大脑皮层提取的NSCs比较胎龄14 d胎鼠和新生24 h内乳鼠大脑皮质均可提取到大量的NSCs。原代培养4 d,观察两组均形成了悬浮的状态良好的神经球,但胎鼠大脑皮质内的杂细胞较乳鼠少(Fig 1)。
3.2 不同培养基对神经球的影响采用无血清培养基组,原代培养4 d,观察形成了状态良好的神经球;采用含血清培基组,原代培养4 d,观察NSCs大部分贴壁分化(Fig 2)。
3.3 不同接种密度对神经球的影响接种密度为1.0×108·L-1的NSCs,培养2 d形成极少量神经球,培养5 d神经球数量增多,但在3组中神经球数量最少,神经球状态良好;接种密度为1.0×109·L-1的NSCs,培养2 d形成少量神经球,培养5 d神经球数量明显增多,且状态良好;密度为1.0×1010·L-1的NSCs,培养2 d形成大量神经球,培养5 d神经球解体,且有大量细胞死亡的现象,在3组中神经球数量最多(Fig 3)。
3.4 不同培养方法对神经球的影响悬浮培养法培养3 d,原代NSCs可形成稳定的神经球,且未出现分化;贴壁培养法的原代NSCs增殖缓慢,培养3 d可见大量细胞分化(Fig 4)。
3.5 不同换液方法对神经球的影响原代培养7 d观察,全量换液组形成的神经球透光性差,神经球边缘有少量死细胞,神经球活力低;半量换液组和只加液不弃液组形成的神经球透光均匀,神经球活力均较高(Fig 5)。
3.6 不同传代方法对神经球的影响原代和1代的神经球:采用机械吹打法即可将神经球分离成单细胞悬液,活细胞比例高,再次成球率高,并可以保持稳定的未分化状态,且较胰酶和Accutase酶消化法方便。2代及以后神经球:采用机械吹打法不能使其完全分离为单细胞;采用胰酶消化法传代后,活细胞比例相对较低,成球率较低;采用Accutase酶消化法,对细胞损伤小,活细胞比例较高,成球率较高,神经球状态良好(Fig 6)。
3.7 NSCs的鉴定结果对培养至3、5、7代的神经球行Nestin免疫荧光染色,荧光显微镜下观察Cy3标记Nestin发红光,表明Nestin免疫荧光染色为阳性,确定培养的细胞为NSCs(Fig 7)。
3.8 NSCs活性检测结果如Fig 8所示,24 h乳鼠胰酶消化组(0.343±0.056)、24 h乳鼠Accutase酶消化组(0.477±0.045)和14 d胎鼠胰酶消化组(0.468±0.107)的吸光度明显低于14 d胎鼠Accutase酶消化组(0.625±0.027),且差异具有显著性(P<0.05)。
4 讨论经大量实验反复摸索后,常规提取胎龄14 d胎鼠,采用无血清培养基,以1.0×109·L-1的密度接种于25 cm2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1~1.5 mL,每6~7 d传代1次(神经球直径为150~250 μm),所得到的NSCs经Nestin免疫荧光染色呈阳性,且NSCs增殖分裂旺盛,成球率高,神经球状态良好,可以保持稳定的未分化状态。
NSCs所具有的迁移性、分化性、趋化性、低免疫原性等独特的生物学特性,使其成为备受瞩目的修复神经损伤的种子细胞,因此,也打破了成熟神经系统不可再生的传统观念。目前,NSCs移植已用于各类神经系统疾病治疗的研究,主要用于:①缺氧缺血性脑损伤,将NSCs移植到缺血缺氧性脑损伤的大鼠脑内,可以提高缺血缺氧性大鼠学习能力和记忆能力[15];②帕金森病,NSCs移植治疗帕金森病在基础和临床研究中已经取得了一定的进展。冷历歌等[16]临床研究发现,帕金森患者经NSCs移植治疗后,临床症状得到明显缓解,生活质量明显提高;③阿尔茨海默病,大量研究证实,NSCs移植可以明显改善阿尔茨海默病鼠的学习记忆能力。目前,关于NSCs治疗人类阿尔茨海默病的报道较少。此外,NSCs移植还在亨廷顿病、脑胶质瘤、外周神经损伤等疾病中发挥治疗作用。加速体外培养NSCs的增殖,控制其处于未分化状态是干细胞移植的首要前提,但是调控NSCs增殖、分化和迁移的机制尚未完全清楚,为了得到纯度更高、状态更好的NSCs,实现基础研究到临床应用的飞跃,我们不仅需要在培养方法上改进,更应该对NSCs的调控机制进行深层次的研究。
( 致谢: 本实验在河北省心脑血管病中医药防治重点实验室完成,感谢各位老师和同学的帮助!)
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