2. 上海市宝山区中西医结合医院药剂科，上海 201901
2. Dept of Pharmacy, Shanghai Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai 201901, China
关节炎是一种可累及全身各关节的炎症性疾病，其表现为关节的红肿热痛、关节的畸形和功能障碍，甚至累及其它器官，进而严重影响患者的生活质量。关节炎的种类较多，其中较常见的是骨关节炎(osteoarthritis, OA)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。关节炎的发病机制尚不明确，但基本认为主要受免疫系统和多种细胞因子影响。
关节炎病变一般始于滑膜组织，进而侵袭关节软骨和骨关节等组织。关节软骨损伤被认为是关节炎主要的病理特征。关节软骨是覆盖在关节内骨表面的一层软骨组织，主要由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成。软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞成分，有维持关节软骨和ECM平衡的作用。ECM主要由组织液、Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen, CII)和蛋白多糖组成。在生理状况下，软骨细胞在合成代谢和分解代谢之间保持平衡，并调节ECM功能的完整。然而，在关节炎中，这种平衡会被打破，软骨细胞、滑膜细胞会产生多种导致关节软骨代谢平衡破坏的细胞因子。这些细胞因子会影响关节软骨细胞的基因表达，促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的分泌，从而抑制CⅡ和蛋白多糖的合成，促进关节炎的进程。
MMPs是一类广泛存在于各种结缔组织中，在ECM的降解过程中起重要作用的蛋白酶超家族。在关节炎中，MMPs的表达增加与关节炎的进程有明显的相关性，通过抑制MMPs的表达可以减缓其发展。如徐锦容等[1]发现，八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide, CCK-8)能下调TNF-α诱导的MMPs的基因表达，从而调控关节炎的发病进程。此外，研究发现，MMP-13作为关节炎中的一种关键酶，会随着疾病的进展而表达增高，并不可逆地降解CⅡ，造成关节软骨的破坏和炎症的发生。MMP-13的表达受多种因素的影响，尤其是Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)。Runx2参与诱导软骨细胞的肥大，进而促进MMP-13的表达。表观调控也是影响MMP-13表达的主要因素。MMP-13启动子区域的低甲基化状态会导致软骨细胞肥大，但可以通过抑制组蛋白脱乙酰化来降低其表达。
1 MMP-13的靶标是CIIMMPs是由23个成员组成的蛋白酶家族，基于其结构特征，可分为分泌型和膜稳定型。其家族成员结构相似，一般由5个功能不同的结构域组成：①疏水信号肽区; ②前肽区; ③催化活性区; ④富含脯氨酸的铰链区; ⑤羧基末端区。其中, 酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。
MMPs在正常人组织中很少表达，多出现在患者关节软骨中。关节软骨主要由ECM和软骨细胞组成。ECM主要是由胶原纤维、蛋白多糖和水分组成，其中胶原纤维和蛋白多糖占20%~30%。在该基质的结构骨架中，主要是由CII组成的胶原纤维构成。软骨破坏是关节炎进展中的关键过程，其特征是软骨蛋白、蛋白多糖和CII的降解。虽然蛋白多糖的损失可以逆转，但CII的降解是不可逆的，并且与MMPs的过度表达有关。
MMP-13是MMPs中尤其重要的一种，它的优选底物是CII，且对CII的降解速度是Ⅰ型胶原的5倍，是Ⅲ型胶原的6倍。MMP-13能识别CII分子中特定的位点，与此结合干扰胶原的三重螺旋，并允许活性酶在CII催化结构域中的Gly775-Leu776处依次切割胶原链[2]。迄今为止，已经在CII中发现2个MMP-13的切割位点, 其中一个是Gly775-Leu776，另一个是Gly778-Gln779[3]。Howes等[2]研究还发现，MMP-13不仅能在典型的MMPs切割位点结合，还能在位于肽Ⅱ-8的较低亲和力的位点结合CII，可见胶原残基对MMP-13的识别也是至关重要的。他们还发现，MMP-13对肽Ⅱ-44的识别主要是由血红素结合蛋白样结构域(hemopexin-like domain, Hpx)介导，并且由P1-P5′或P9′-P14′的GLXGQR基序所确定。
2 MMP-13在关节软骨和滑膜细胞中的调节 2.1 MMP-13受细胞因子调节在关节炎中，软骨损伤是其主要特征，它是由合成代谢和分解代谢的平衡破坏所导致。关节软骨对环境和细胞因子的应激非常敏感，过度负荷或炎性细胞因子的刺激都会诱导炎症反应和细胞凋亡，并激活MMP-13。在关节炎病变中，IL-1β和TNF-α被认为是促炎因子中主要的参与者。在关节炎患者中，IL-1β和TNF-α在滑膜和软骨中的表达明显升高。IL-1β和TNF-α会刺激软骨细胞释放MMPs：MMP-1、MMP-3、MMP-13。这3种MMPs是调节软骨破坏的关键酶，尤其是MMP-13。IL-1β和TNF-α的促炎和分解代谢作用是通过激活多条信号通路来介导的，包括c-Jun N末端激酶通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路、NF-κB通路，其中最重要的是NF-κB通路。NF-κB通路介导多种炎症基因的表达，如编码iNOS、COX-2和趋化因子等炎症基因，这些都有助于诱导MMP-13的表达。除了IL-1β和TNF-α，近几年研究还发现，IL-37也与MMP-13有着密切关系。van Geffen等[4]发现，IL-37由IL-1β诱导，但IL-37本身能减少IL-1β的产生，并降低IL-1β驱动的MMP-13的表达。
2.2 MMP-13受Runx2调控Runx2是一种骨转录因子，在骨内形成期间主要是使软骨细胞肥大。在关节炎软骨中，Runx2的参与会诱导软骨细胞肥大，进而诱导MMP-13的表达。正常情况下，软骨细胞保持稳定的状态，并且对肥大状态具有抵抗性。然而，在关节炎期间，软骨细胞会失去稳定的状态并增殖分化，从而导致MMP-13表达的增加。MMP-13是软骨损伤的主要参与者，且在关节炎中表达明显上调。Runx2先通过诱导X型胶原的表达，然后肥大软骨细胞再诱导MMP-13的表达。Arumugam等[5]研究发现，Runx2的磷酸化对TGF-β1诱导的MMP-13启动子的活化非常重要。一般来说，Runx2的磷酸化主要是依赖于细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和p38 MAPK两条通路，且Runx2的磷酸化是维持软骨细胞中MMP-13表达所必需的。进一步研究发现，Runx2活性被组蛋白脱乙酰酶4(histone deacetylase 4, HDAC4)激活后，将导致软骨细胞中MMP-13的表达降低[6]。此外，HDAC3也被证明能抑制ERK的磷酸化以及下游靶标Runx2，从而导致软骨细胞中的MMP-13活性受到抑制[7]。有研究发现，在小鼠软骨细胞中特异性敲除Runx2，能明显抑制MMP-13的表达[8]。因此，Runx2被认为是调控MMP-13的重要因素。
2.3 MMP-13的表观遗传调控关节炎是一种常见的退行性疾病，虽然其具体机制尚不清楚，但遗传改变被认为是其病理学的关键因素之一。越来越多的证据表明，基因表达可以通过调控表观遗传信息进行调控。在哺乳动物中，主要的表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA调控[9]。
DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，在不改变DNA序列的前提下，改变其遗传表现，是一种外遗传机制。DNA甲基化是使甲基添加到DNA分子上，从而调节基因的表达。近十几年来，研究人员研究了关节炎进展期间个体基因DNA甲基化的状态，发现Col10a1的启动子通过其上调，在软骨细胞肥大期间呈低甲基化状态[10]。在关节炎组织中，MMP-13的启动子区域内的CpG位点呈低甲基化状态，并且低甲基化状态与软骨细胞中MMP-13表达的增加有明显的相关性[11]。在软骨细胞的成熟过程中，多种转录因子的DNA甲基化状态也会发生变化。这些转录因子的启动子区域内的DNA甲基化促进了基因转录，进一步激活下游信号分子，并最终导致软骨细胞肥大和软骨破坏[12]。
与DNA甲基化密切联系的是组蛋白修饰。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化等修饰的过程。最近的研究表明，组蛋白乙酰化和脱乙酰化是通过影响软骨细胞的合成代谢和分解代谢来参与关节炎的发病过程。组蛋白乙酰化是松动DNA结构的关键步骤，促使调节因子进入转录过程并开启随后的基因表达，而脱乙酰化被认为是基因表达的抑制。在关节炎患者中，有研究者发现，组蛋白脱乙酰酶7(HDAC7)通过诱导MMP-13的表达，促进软骨的破坏。且在体外，抑制HDAC7会导致炎症因子诱导的MMP-13表达降低[13]。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一种内源性非编码RNA，它们通过结合靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)的非翻译区来调节基因的表达。miRNA在RNA的稳定性和蛋白质负调控表达中起着非常重要的作用。至今已发现多种相关miRNA，如miRNA-140。Miyaki等[14]发现，miRNA-140可以调节软骨发育，并且其下调会促进软骨的退化。IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子可以在软骨细胞中诱导MMP-13的表达。Liang等[15]研究发现，miRNA-140和MMP-13在IL-1β刺激的C28/I2细胞中上调，且通过荧光素酶报告基因测定和抗miRNA寡核苷酸转染发现，miRNA-140抑制MMP-13的表达，并且是由转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)机制所介导的。
3 MMP-13是关节炎发生发展的分子靶标MMPs在ECM的降解中发挥着重要的作用。在关节炎中，许多MMPs，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-13等，都在关节软骨中表达。在各种MMPs中，MMP-13对胶原蛋白降解最为重要。MMP-13在胚胎初期的软骨细胞和成骨细胞中表达，被认为参与了软骨内骨化和骨重塑。MMP-13过表达的转基因小鼠会产生自发的关节软骨破坏，而MMP-13敲除的小鼠则会在软骨内骨化出现明显缺陷。这些发现都说明软骨降解的关键酶MMP-13，是关节炎发生发展过程的分子靶标。因此，设计和合成针对MMP-13的靶向药物治疗关节炎是当今比较热门的研究方向。
MMP-13的结构由前结构域、催化结构域、铰链区和血液凝集素结构域组成。MMP-13在催化结构域中具有保守的活性位点基序，但S1′环区除外。已经有人提出，MMP-13的长环大小是MMP-13抑制剂选择性结合的决定因素。大多数传统的锌结合抑制剂(zinc binding inhibitors, ZBIs)占据具有芳基疏水结构的S1′位点，但不与S1′残基接触，表明抑制效力是与锌结合基团(zinc binding groups, ZBG)相关。ZBIs，特别是异羟肟酸盐，随着剂量递增副作用明显加大。为了克服与经典MMPs抑制剂的选择性和毒性相关问题，研究者现开始研究这两个方向：①用较小效力和更有选择性的ZBG; ②以二级结合位点作为靶点[16]。后者产生了新型非锌结合抑制剂(non-zinc-based inhibitors, NZBIs)的设计思路。MMPs在活性位点以外的S1′环区中具有明显的差异，特别是MMP-13具有大的S1′环区。这些结构特征已经被用来发现了许多有效和选择性的MMP-13抑制剂。虽然开发锌结合选择性MMP-13抑制剂相当具有挑战性，但可以通过微调P1′片段与S1′亚位的深度结合合适的ZBG，来实现良好的MMP-13选择性，如AZD6605[17]。
NZBIs由于缺乏特定性，可以更好地探索特异性位点中可能的作用。另一方面，非锌结合选择性MMP-13抑制剂预期可以保护软骨免受肌肉骨骼综合症的影响。研究人员通过动力学模拟分析发现，S1′区域的构象变化与NZBIs的活动无关，主要是与特异性环残基的结合来显示其效力和选择性。目前，许多NZBIs都已被开发。如2014年，Nara等[18]通过高通量筛选MMP-13抑制剂发现，化合物PDB显示高效力和高选择性。NZBIs在结构上非常相似，因此，研究人员将会以MMP-13结构模板为高性能模型，通过不断摸索，筛选出更高效的MMP-13抑制剂。
4 MMP-13在各种关节炎中的作用 4.1 MMP-13在OA中的作用OA是一种关节退行性疾病，目前没有明确的治疗方法可以延缓其进程。OA的主要病理特征包括关节软骨的进行性缺失、关节周围和软骨下骨的退化。而关节软骨在OA的研究中受到最多的关注，因为OA中最主要的病理特征就是关节软骨的损伤。其中，MMP-13是靶向降解软骨的主要酶。临床研究发现，MMP-13在软骨破坏的患者中表达含量明显增高。还有研究发现，MMP-13基因全敲除可以预防关节软骨的损坏[19]。上调MMP-13可以影响软骨的内稳态，引起关节疾病，下调MMP-13则可以达到治疗OA的作用。Bouaziz等[20]研究发现，低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)通过下调Wnt /β-连环蛋白信号，降低MMP-13的表达，从而防止软骨细胞的分解代谢和软骨损失。因此，MMP-13对于OA的病情发展至关重要，研发抑制MMP-13的药物可能是减慢OA关节软骨破坏的有效策略。
MMP-13的选择性抑制剂是最近几年研究的热点。De Savi等[17]在2013年研究发现了一种新的MMP-13选择性抑制剂AZD6605。它具有良好的物理学参数和优异的药物动力学参数，对豚鼠的OA显示出明显的抑制作用，而且毒性实验中也显示出极好的安全性。由于其良好的活性和选择性，AZD6605已经被阿斯利康作为治疗OA的候选药物。Nara等[18]研究也发现了一种新的抑制剂喹唑啉-2-甲酰胺，它在实验动物上显示较低的生物利用度，但其钠盐表现出较好的生物利用度，并能有效地抑制OA的软骨退化，因此作为治疗OA的候选药物。除此之外，吡啶亚胺四唑衍生物、吡唑-吲哚衍生物、吡唑并嘧啶衍生物等都具有良好的体外和体内活性，具有进一步开发为治疗OA药物的潜力[21]。
4.2 MMP-13在RA中的作用RA是一种慢性、进行性的自身免疫系统疾病，其病理特征主要是滑膜长期慢性炎症，进而造成软骨以及骨关节破坏。关节软骨被蛋白水解酶降解是RA的主要特点，其中MMP-13起着重要的作用，且与RA的活动性和预后有关。Singh等[22]发现，MMP-13促进K/BxN血清诱导的关节炎模型中的炎症反应和关节破坏。在该项研究中，作者使用了MMP-13-/-小鼠，发现MMP-13缺失会减缓小鼠的关节炎进展。他们的研究还发现，MMP-13上调炎症反应与促进软骨破坏有直接关系。因此，抑制MMP-13的药物可能是治疗RA的有效方式。Lin等[23]研究发现，15-脱氧-Δ(12, 14)-前列腺素-J2和曲格列酮可以通过调节NF-κB通路信号转导，减弱成纤维样滑膜细胞中TNF-α诱导的MMP-13的表达。Julovi等[24]研究发现，透明质酸可能通过抑制RA软骨细胞内的p38 MAPK信号通路，进而抑制IL-1β诱导的MMP-13表达，从而抑制RA。Jüngel等[25]研究发现，MMP-13抑制剂能明显改善RA中对软骨和关节破坏的影响。在该实验中，研究人员分析了MMP-13抑制剂对3种RA动物模型的抗破坏作用，发现MMP-13抑制剂在破坏性模型中有效，而在炎症模型中无效。
4.3 MMP-13在其他类型关节炎中的作用MMP-13不止在OA和RA中具有重要的作用，在其他类型的关节炎中也是如此，比如颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis, TMJ-OA)。TMJ-OA是成人中常见的退行性疾病，其特征是关节软骨的进行性破坏。MMP-13主要在软骨细胞中合成，并被认为是TMJ-OA关节软骨中ECM降解的主要原因。MMP-13不仅降解胶原蛋白，还可降解非胶原基质蛋白(如蛋白聚糖)。Hamamura等[26]研究发现，内质网应激导致软骨细胞中MMP-13 mRNA的转录上调，并进一步通过p38 MAPK的活化，促进TMJ-OA的炎症反应。Wang等[27]研究发现，β-连环蛋白的活化造成Runx2的表达上调，进而促进软骨组织中MMP-13的表达，导致TMJ-OA软骨的退行性损坏。
除了TMJ-OA，研究人员还发现，在细菌性关节炎的炎症期间也会产生大量的MMPs。虽然MMP-13在OA和RA患者的关节软骨中分泌，参与关节和软骨的破坏，但MMP-13参与细菌性关节炎尚未得到肯定。Sakurai等[28]发现，A型链球菌(group A streptococcus, GAS)感染软骨细胞，会导致MMP-13表达增加和ECM降解。因此，细菌感染产生的MMP-13可能有助于细菌性关节软骨的破坏。他们随后通过体外黏附和侵袭测定发现，GAS的侵袭性感染通过产生MMP-13，诱导ECM的降解。通过蛋白质印迹分析还发现，GAS感染通过激活c-Jun N末端激酶和AP-1转录因子，诱导软骨细胞中MMP-13的表达。因此，MMP-13是GAS诱导细菌性关节炎ECM降解的重要媒介。
5 总结与展望关节炎的发病机制非常复杂，它是多种免疫细胞和炎性因子相互影响的结果。炎性因子会上调MMP-13，促进软骨的退化，而软骨的破坏又会进一步促进炎性因子的释放。因此，抑制MMP-13的表达是减轻关节炎症状的有效方式。由于非选择性MMP-13抑制剂会出现多种不良反应，研究人员更倾向于开发针对性强的选择性MMP-13抑制剂。他们可以根据MMP-13结构域中相关的催化位点，再通过高通量的计算来筛选合适的药物，目前相关的研究工作正在进行中。此外，通过表观调控下调MMP-13的表达也是一个研究的热点。研究人员发现，MMP-13启动子区域内的CpG低甲基化状态与MMP-13表达的增加有明显的相关性，而乙酰化则可以抑制其表达。目前，已经有多种HDAC抑制剂被应用于关节炎的治疗，且副作用较小。但HDAC抑制剂针对的是整个基因组，而不是特定的基因。因此，我们可以针对特定的基因来筛选抑制剂，从而增强其靶向性和稳定性。综上，MMP-13在软骨重塑及关节炎中起着举足轻重的作用，由于MMP-13的表达受多种因素影响，我们可以深入研究相关分子机制，开发出更高效的MMP-13选择性抑制剂，以提高药物特异性并降低不良反应，从而预防和治疗各种关节炎。
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