2. 山东省中西医结合医院药学部，山东 济南 250001;
3. 山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，山东 济南 250355
2. Dept of Pharmacy, Shandong Provincial Hospital of Integrated Medicine, Jinan 250001, China;
3. Classical Chinese MedicineTheory Key Lab of Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
高架+字迷宫实验(elevated plus maze，EPM)[1]和高架〇迷宫实验(elevated zero maze，EZM)[2]是国际公认的用于评价状态焦虑动物模型情绪反应的经典方法，广泛应用于精神神经药理学基础研究。EPM和EZM都是基于实验动物探索习性与外界危险环境之间的矛盾冲突，都属于非条件式行为性动物模型; EPM和EZM作为状态焦虑动物模型，常受实验动物、实验环境、实验操作等诸多因素影响而导致结果不尽一致[3-4]。本研究采用描述性分析、聚类分析、因子分析、相关分析、一致性检验等多种统计方法，初步探讨EPM和EZM作为昆明小鼠状态焦虑动物模型的行为模式与结构维度相关性等问题。
1 材料与方法 1.1 实验动物昆明小鼠，♂/♀，由山东大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)20130001。室温(20±2)℃，光照12 h(18 :00~6 :00)和黑暗12 h(6 :00~18 :00)环境，自由进水饮食饲养; 预适应环境1周后，选取体质量(20±2)g小鼠进入正式实验(所有实验均于6 :00~18 :00进行)。
1.2 实验装置木质+迷宫(65 cm×5 cm)，包括3部分：两相对开臂区(30 cm×5 cm)、两相对闭臂区并附有立墙(30 cm×5 cm×30 cm)、中央区(5 cm×5 cm)。十字迷宫离地面50 cm，实验由25 W红灯泡离中央区40 cm高处照明[5]。木质〇迷宫(ϕ 50 cm×5 cm)，包括2部分：两相对开臂区(ϕ 50 cm×5 cm，1/4 〇)、两相对闭臂区并附有立墙(ϕ 50 cm× 5 cm×30 cm, 1/4 〇); 〇迷宫离地面50 cm，实验由25 W红灯泡离圆心40 cm高处照明[6]。
1.3 实验操作操作者将小鼠放入EZM(开臂区中间，头面对圆心)或EPM(中央区，头面对开臂区)，用摄像系统记录动物5 min的行为变化，包括进入时间及进入次数。其中，小鼠4只爪子由一臂区进入另一臂区方可开始记录实验参数。每只动物实验结束后清除粪便，用70%乙醇喷洒箱底并用洁净纱布抹干，以免前一只动物的残留气味造成对本次实验的影响。全部实验结束后，由不熟悉实验设计人员进行数据提取录入。EPM/EZM纳入实验参数有：进入时间百分率(开臂区Otime%, 十字央区Ptime%, 闭臂区Ctime%)及两臂区进入总次数(Entries); 而后总体实验数据会再进行分割细化处理，按照5个重复测量片段(1 min)来进行提取。
1.4 统计学分析采用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计分析，GraphPad Prism 5.0软件进行统计作图。Kolmogorov-Smirnov检验由Analyze → Nonparametric Tests → 1 Sample Kolmogorov-Smirnov Test程序完成。t检验由Analyze → Compare Means → Paired Samples T Test程序完成; Wilcoxon检验由Analyze → Nonparametric Tests → 2 Related Samples Tests程序完成; 重复测量ANVOA由Analyze → General Linear Model → Repeated Measures ANOVA程序完成; Friedman检验由Analyze → Nonparametric Tests → K Related Samples Tests程序完成。聚类分析参数由Analyze → Classify → Hierarchical Cluster Analysis程序完成，采用R型变量聚类，选择Between-groups linkage测量方法和Pearson Correlation距离类型。因子分析由Analyze → Data Reduction → Factor Analysis程序完成，先进行KMO和Bartlett球形检验，以Principal components提取公因子，以累计贡献率>80%作为因子纳入标准，采用Varimax正交旋转。相关分析由Analyze → Correlate → Bivariate Correlations程序完成，依据数据类型选择Pearson或Spearman相关系数。一致性采用ICC和κ统计参数来评价，其中ICC参数主要适用于连续变量或等级变量，由Analyze → Scale → Reliability Analysis程序完成; κ参数主要适用于分类变量，由Analyze → Descriptive statistics → Crosstabs程序完成，分析前首先根据1st分位数、3rd分位数进行低(≤1st分位数)、中(>1st分位数，＜3rd分位数)、高(≥3rd分位数)状态分类; ICC/κ：>0.75认为一致性很好，0.50~0.75认为一致性一般，< 0.50则认为一致性较差。所有数据先进行正态分布检验，P < 0.05表示差异有统计学意义[5-6]。
2 结果 2.1 EPM/EZM行为模式Kolmogorov-Smirnov正态分布检验结果显示，EPM/EZM总体实验参数Otime%(♂，♀，♂+♀：P>0.05)、Entries(♂，♀，♂+♀：P>0.05)均符合正态分布，而EPM/EZM重复测量实验参数Otime%(♂，♀：P>0.05)、Entries(♂：P>0.05)则仅部分符合正态分布。总体实验参数t检验结果显示(Fig 2)，与EPM相比，EZM Otime%均降低，差异具有统计学意义(♂：t=2.434，P < 0.05;♀：t=4.199，P < 0.01;♂+♀：t=4.545，P < 0.01);而Entries均升高，且除♀外差异均有统计学意义(♂：t=-3.405，P < 0.01;♀：t=-1.870，P>0.05;♂+♀：t=-3.502，P < 0.01)。重复测量实验参数Fiedman检验结果提示(Fig 3)，EPM Otime%(♂：χ2=17.687，P < 0.01;♀：χ2=25.852，P < 0.01;♂+♀：χ2=38.194，P < 0.01)、Entries(♂：χ2=18.682，P < 0.01;♀：χ2=19.282，P < 0.01;♂+♀：χ2=30.877，P < 0.01)，EZM Otime%(♂：χ2=12.105，P < 0.05;♀：χ2=29.349，P < 0.01;♂+♀：χ2=36.911，P < 0.01)、Entries(♂：χ2=12.272，P < 0.05;♀：χ2=15.394，P < 0.01;♂+♀：χ2=24.237，P < 0.01)，重复测量片段间差异均有统计学意义; Wilcoxon检验结果提示，与EPM相比，EZM Otime%在1st min(♂：z=-3.806，P < 0.01;♀：z=-3.001，P < 0.01;♂+♀：z=-3.699，P < 0.01)、2nd min(♂：z=-3.042，P < 0.01;♀：z=-3.393，P < 0.01;♂+♀：z=-4.486，P < 0.01)、3rd min(♀：z=-2.208，P < 0.05;♂+♀：z=-2.687，P < 0.01)均降低且差异有统计学意义，而Entries在1st min(♂：z=-2.510，P < 0.05;♂+♀：z=-2.529，P < 0.05)、4th min(♂：z=-3.100，P < 0.01;♀：z=-2.895，P < 0.01;♂+♀：z=-4.253，P < 0.01)、5th min(♂+♀：z=-2.546，P < 0.05)，均升高，且差异有统计学意义。
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| Fig 1 Structure diagram of elevated plus maze (EPM) and elevated zero maze (EZM) |
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| Fig 2 Comparison of time preference for each component between EPM and EZM during a 5-minute observation period (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45) |
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| Fig 3 Behavioral pattern of EPM and EZM for Otime% & Entries parameters during a 5-minute observation period (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45) *P < 0.05, **P < 0.01 vs EPM |
聚类分析结果提示(Fig 4)，EPM/EZM实验参数可分两类：EPM实验参数主要属于第1类，反映EPM类行为; EZM实验参数主要属于第2类，反映EZM类行为; 且该聚类分组不受性别影响。
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| Fig 4 Dendrogram for parameters of EPM and EZM by cluster analysis (♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45) |
KMO和Bartlett球形检验提示，EPM/EZM参数变量并不独立，相关性尚可，适合进行因子分析(♂/♀/♂+♀：KMO=0.506/0.556/0.553，χ2=51.366/59.880/108.919，P < 0.01)。因子分析提示(Tab 1)：EPM实验参数主要对因子F1(EPM因子，♂/♀/♂+♀：46.032%/39.982%/43.817%)贡献大; EZM实验参数主要对因子F2(EZM因子，♂/♀/♂+♀：47.030%/49.604%/47.543%)贡献大; 且该因子分组不受性别影响。
| Parameter | ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||
| F1 | F2 | F1 | F2 | F1 | F2 | |||
| EPM Otime% | - | 0.955 | - | 0.844 | - | 0.915 | ||
| EPM Entries | - | 0.944 | - | 0.921 | - | 0.934 | ||
| EZM Otime% | 0.958 | - | 0.979 | - | 0.963 | - | ||
| EZM Entries | 0.962 | - | 0.969 | - | 0.963 | - | ||
| Loading% | 47.030 | 46.032 | 49.604 | 39.982 | 47.534 | 43.817 | ||
| ♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45 | ||||||||
Kolmogorov-Smirnov正态分布检验提示，所有EPM/EZM总体实验参数均符合正态分布(P>0.05)，故采用Pearson相关分析。相关分析提示(Tab 2)：EPM和EZM实验参数Otime%(♂：Pearson=-3.806，P>0.05;♀：Pearson=0.356，P>0.05;♂+♀：Pearson=0.320，P < 0.05)、Entries(♂：Pearson=0.297，P>0.05;♀：Pearson=0.184，P>0.05;♂+♀：Pearson=0.244，P>0.05)均具有一般正相关。
| EPM | ||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | ||||||||
| Otime% | Entries | Otime% | Entries | Otime% | Entries | |||||
| EZM | ♂ | Otime% | 0.263 | |||||||
| Entries | 0.297 | |||||||||
| ♀ | Otime% | 0.356 | ||||||||
| Entries | 0.184 | |||||||||
| ♂+♀ | Otime% | 0.320* | ||||||||
| Entries | 0.244 | |||||||||
| ♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45;*P < 0.05 | ||||||||||
一致性检验结果提示(Tab 3、4)，EPM和EZM实验参数Otime%(♂：ICC=0.411，P < 0.01;♀：ICC=0.525，P < 0.05;♂+♀：ICC=0.483，P < 0.01;♂+♀：κ=0.282，P < 0.01)具有一般一致性; EPM和EZM实验参数Otime%、Entries低、中、高状态κ一致性分类情况具体见Tab 5、6。
| Parameter | EPM | EZM | ICC | ||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||
| Otime% | 23.14±2.81 | 20.12±1.83 | 21.53±1.63 | 15.49±2.33 | 11.19±1.92 | 13.20±1.51 | 0.411* | 0.525* | 0.483* | ||
| Entries | 12.00±1.38 | 10.42±1.04 | 11.16±0.85 | 20.57±2.56 | 16.33±3.19 | 18.31±2.08 | 0.398 | 0.195 | 0.291 | ||
| x±s, ♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45. *P < 0.05 | |||||||||||
| Parameter | EPM | EZM | κ | ||||||||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||||||||
| 1st | 3rd | 1st | 3rd | 1st | 3rd | 1st | 3rd | 1st | 3rd | 1st | 3rd | ||||||||||
| Otime% | 11.17 | 35.00 | 12.92 | 27.17 | 12.50 | 30.33 | 8.00 | 22.67 | 4.67 | 14.50 | 5.50 | 17.33 | -0.065 | 0.279 | 0.282** | ||||||
| Entries | 7.00 | 18.00 | 7.00 | 15.75 | 7.00 | 17.00 | 12.50 | 29.50 | 4.67 | 25.25 | 7.50 | 28.00 | 0.271 | 0.238 | 0.189 | ||||||
| Q, ♂ n=21, ♀ n=24, ♂+♀ n=45. **P < 0.01. | |||||||||||||||||||||
| EZM | EPM | ||||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||||||||
| Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | ||||
| ♂ | Low | 0 | 5 | 0 | 5 | ||||||||||
| Medium | 4 | 4 | 3 | 11 | |||||||||||
| High | 1 | 1 | 3 | 5 | |||||||||||
| Total | 5 | 10 | 6 | 21 | |||||||||||
| ♀ | Low | 3 | 1 | 3 | 7 | ||||||||||
| Medium | 2 | 8 | 1 | 11 | |||||||||||
| High | 1 | 3 | 2 | 6 | |||||||||||
| Total | 6 | 12 | 6 | 24 | |||||||||||
| ♂+♀ | Low | 3 | 6 | 2 | 11 | ||||||||||
| Medium | 6 | 15 | 2 | 23 | |||||||||||
| High | 2 | 2 | 7 | 11 | |||||||||||
| Total | 11 | 23 | 11 | 45 | |||||||||||
| ♂ n=21, κ=-0.065; ♀ n=24, κ=0.279; ♂+♀ n=45, κ=0.282 | |||||||||||||||
| EZM | EPM | ||||||||||||||
| ♂ | ♀ | ♂+♀ | |||||||||||||
| Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | Low | Medium | High | Total | ||||
| ♂ | Low | 3 | 1 | 1 | 5 | ||||||||||
| Medium | 4 | 5 | 2 | 11 | |||||||||||
| High | 0 | 2 | 3 | 5 | |||||||||||
| Total | 7 | 8 | 6 | 21 | |||||||||||
| ♀ | Low | 5 | 0 | 1 | 6 | ||||||||||
| Medium | 2 | 6 | 4 | 12 | |||||||||||
| High | 2 | 3 | 1 | 6 | |||||||||||
| Total | 9 | 9 | 6 | 24 | |||||||||||
| ♂+♀ | Low | 6 | 2 | 3 | 11 | ||||||||||
| Medium | 8 | 10 | 4 | 22 | |||||||||||
| High | 2 | 5 | 5 | 12 | |||||||||||
| Total | 16 | 17 | 12 | 45 | |||||||||||
| ♂ n=21, κ=0.271; ♀ n=24, κ=0.238; ♂+♀ n=45, κ=0.189 | |||||||||||||||
EPM是Handley等[7]根据Montgomery[8]提出的高架“Y”迷宫模式衍化而来，并发现抗焦虑药物能明显增加EPM开臂区进入次数，致焦虑药物能明显减少EPM开臂区进入次数，而肾上腺素受体不同亚型激动剂和拮抗剂则表现出不同药理效应。Lister等[9]研究发现，抗焦虑药物和致焦虑药物可明显改变小鼠EPM开臂区进入时间百分率，抗抑郁药物则无此效应，并发现EPM开臂区进入次数百分率、开臂区进入时间百分率区别于孔板实验(hole-board，HB)探索行为，而EPM两臂区进入总次数则类似于HB自发运动。而EZM源于EPM，相当于EPM变型，是由Shepherd最先提出，并发现抗焦虑药物可明显增加SD大鼠EZM开臂区进入时间百分率和开臂区低头探索频次，减少由EZM闭臂区向开臂区伸躯探索频次，而致焦虑药物则产生相反效应。Cook等[10]研究发现，不同品系辨别EZM初始位置依靠不同感官信息(视觉、嗅觉等)。Milner等[11]研究发现，EZM、旷场实验(open filed test，OFT)和明暗箱实验(light dark box，LDB)反映状态焦虑情绪和运动探索活动相关实验参数无法区分。Kulkarni等[12]研究发现，EZM对以苯二氮卓类受体-γ-氨基丁酸A受体-氯离子通道复合物为作用靶点的工具药物均有效。
本研究行为模式分析结果提示，昆明小鼠在EZM焦虑情绪比EPM明显降低，而运动探索活性则比EPM明显升高; 聚类分析与因子分析结果则提示，EPM/EZM实验参数分属于两个不同行为结构维度，即EPM和EZM，且不受性别影响，但其反映焦虑情绪状态与运动探索活动参数并未区分开; 相关分析结果提示，EPM与EZM反映焦虑状态与运动探索活动实验参数在不同性别间均具有一般相关性; 一致性检验结果提示，EPM与EZM实验参数仅Otime%一致性尚可接受。尽管EPM与EZM具有相类似原理：基于实验动物探索习性与危险环境间矛盾冲突，但是EZM又不同于EPM[5-6]：①没有中央区，不存在中央“死时间”; ②实验动物探索行为是连续的，不受两臂区末端影响; ③两臂区之间可以直接转换，不需要经过中央区过渡; ④EZM两臂区进入次数通常相等或者仅差1，导致两臂区进入次数百分率实验参数失去评价意义; 可能正是因为EZM缺乏中央区，行为模式不需要过渡，导致昆明小鼠对开臂区与闭臂区辨识度高(Otime%↓); 而环路闭合连续，则运动探索通路畅通无阻(Entries↑)。
EPM/EZM状态焦虑动物模型行为模式常受性别、年龄、重复测量、前后不同实验组合顺序以及实验参数等诸多因素影响而导致结果不尽一致。Braun等[13]研究发现，♂空白SD大鼠EZM实验参数Otime%明显高于EPM，而♂/♀SD大鼠EPM/EZM实验参数对抗焦虑和致焦虑因子(药物及其他束缚应激等)应答差异无统计学意义。前期研究发现，昆明小鼠EPM/EZM重测信度受性别与重复测量效应不同影响：EPM行为模式受性别与重复测量效应影响较大，而EZM行为模式仅受性别效应影响[5-6]; ♀Wistar大鼠EPM实验参数Otime%、Oentries%及Entries具有较好重测信度[14]。动物模型行为具有多维性，是结构和功能共同相互作用的结果，而基于基因与环境共同作用及“行为组学”模式研究[15]将是动物模型未来发展方向。
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