2. 中原大学生物科技系表皮干细胞研究室，台湾 32023
2. Epidermal Stem Cell Lab, Chung Yuan Christian Univ. Taiwan 32023, China
随着生活方式、污染等多种因素的影响，日益增多的皮肤疾病受到了越来越多的关注。皮肤损伤动物模型在皮肤组织损害的病因形成、发病机制、新药的研究、物代谢药动力学的研究中被广泛应用，为制定临床治疗方案发挥了重要的作用。长春新碱(vincristine, VCR)是临床常用抗肿瘤药物，常规给药方式为静脉滴注。临床报告显示，长春新碱接触皮肤可以导致轻度的皮肤组织炎症反应，甚至引起皮肤组织的局部水肿坏死[1-2]，显示其造成皮损的特性。近年来，新兴模式生物斑马鱼(Danio rerio)已成为一种理想的动物模型，并广泛应用于药物前体的筛选，如抑制血管生成、血栓病、阿尔茨海默症、抑郁症/焦虑等相关领域[3]。在本研究中，我们选用VCR作为工具药物，采用了皮肤角蛋白4(keratin 4, KRT4)荧光标记的转基因斑马鱼Tg(krt4:NTR-hKikGR)作为实验动物，由于该品系的胚胎在受精后24~96 h皮肤细胞在荧光显微镜下清晰可见，利用该模型的优势，考察VCR对胚胎皮肤细胞荧光表达的影响，建立斑马鱼皮肤损伤模型，并初步探讨其分子机制。
1 材料 1.1 实验动物转基因斑马鱼Tg(krt4:NTR-hKikGR)由本实验室养殖，种鱼来自于台湾中原大学生物科技系表皮干细胞研究室。
1.2 试剂甲硝唑(metronidazol，MT)，纯度≥99%，购自上海生物化工公司，批号：LC0826B38，用0.1%二甲基亚砜助溶，配制成终浓度1 mol·L-1水溶液储液，置冰箱中备用; 长春新碱(纯度≥99%，批号：55227)由上海同田提供。TUNEL试剂盒购自Roche公司; 兔抗鼠caspase-3抗体购自BD公司; 兔抗鼠p53抗体购自PTG公司; KRT4多克隆抗体购自上海信裕生物科技公司; β-actin一抗购自Santa Cruz公司; 羊抗兔二抗购自康为生物。
1.3 仪器SZX16荧光显微镜(Olympus，日本); COIC体视显微镜ZSA302(重庆光学仪器厂); LRH-250-G光照培养箱(广东医疗器械厂); 稳压稳流电泳仪(24DN型)与转印电转仪(40DN型)，购自北京六一; ChemiDoc XRS化学发光成像系统(伯乐公司)。
2 方法 2.1 胚胎的准备斑马鱼的养殖和培育参照Westerfield等[4]的方法，培养用水包含：5 mmol·L-1 NaCl、0.17 mmol·L-1 KCl、0.4 mmol·L-1 CaCl2、0.16 mmol·L-1 MgSO4，培养水温度26℃。选择成熟斑马鱼♀♂ 1对，傍晚时放入产卵缸中，d 2产卵后，取出受精卵，纯净水反复冲洗3次，然后放入28℃光照培养箱备用。
2.2 分组给药鱼胚胎于受精后24 h取出，置于50 μmol·L-1链霉蛋白酶溶液中数分钟后，用吸管吹去胚胎卵膜，将胚胎加入24孔板中，每孔30只; 设空白对照组、甲硝唑组(10 mmol·L-1)、长春新碱0.01~0.04 mmol·L-1剂量组，将实验药物加入24孔板中，空白对照组不加任何药物; 加药后将24孔板放入光照培养箱孵育24 h。将胚胎从24孔板取出，每孔取出100 μL溶液，加入3.5 μmol·L-1三卡因溶液麻醉鱼体，随后用吸管吸出鱼体放于载玻片上，在荧光显微镜下观察记录斑马鱼胚胎皮肤荧光斑点，拍照并在卵黄囊中心区域取200×200像素面积图像，进行荧光点计数，与对照组比较进行统计分析。
2.3 TUNEL分析选用24 h给药后的斑马鱼胚胎，选择空白对照组与长春新碱胚胎组分别进行TUNEL染色。将6只胚胎用4%多聚甲醛固定6 h，PBST清洗3次，加入0.1 mol·L-1柠檬酸钠溶液处理30 min，PBS清洗2次，加入0.88 mmol·L-1 H2O2室温孵育10 min，按照TUNEL试剂盒要求染色，移除染液，加入Converter POD约30 min，经PBST清洗2次，经DAB处理后，置于显微镜下，选择躯干部位拍照。
2.4 Western blot分析另取脱膜24 h Tg斑马鱼胚胎分组，分别为空白对照组、长春新碱0.01~0.04 mmol·L-1剂量组，药物处理24 h，实验结束后，斑马鱼机械法去除卵黄，鱼体匀浆粉碎，加入冷组织蛋白提取液，匀浆后冰浴静置10 min，然后4℃离心10 min，得上清液为蛋白提取液。每组样品取30 μg蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后把蛋白转移到PVDF膜上，再用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h。与兔抗鼠p53抗体4℃孵育过夜(1 :500)。TBST洗涤后，加入羊抗兔IgG(1 :8 000)室温孵育1 h。TBST充分洗涤后，ECL显色，化学发光成像系统拍照。利用Image J软件测条带灰度值，计算目的蛋白p53的灰度比值。caspase-3、KRT4和β-actin的检测方法与p53相同。
2.5 统计学分析各组指标均以x±s表示，使用SPSS 13.0统计软件进行统计描述，多个样本均数采用单因素方差分析及t检验。
3 结果 3.1 VCR对斑马鱼皮肤细胞的作用对照组斑马鱼生长良好，无病理改变及畸形，躯体及眼睛均覆盖荧光斑点，均匀分布，边界清晰，无缺失(Fig 1A); MT组生长良好，头部及卵黄部位的荧光斑点几乎全部消失，少数出现心脏水肿(Fig 1B); 在VCR作用24 h后，0.02、0.04 mmol·L-1组斑马鱼均出现荧光斑点数量明显缺失(P < 0.01)，皮肤出现环形凹陷，荧光变弱等变化(Fig 1C、1D)，并呈现剂量依赖特征，与对照组比较两组均出现了翘尾畸形、卵黄膨大等发育延迟等现象。
|
| Fig 1 VCR causes skin cell ablation in Tg (krt4:NTR-hKikGR) zebrafish A: Control Tg (krt4:NTR-hKikGR); B: Tg embryos were treated with 10 mmol·L-1 metronidazole; C, D: Tg embryos were treated with 0.02 mmol·L-1 VCR and 0.04 mmol·L-1 VCR; E: The number of fluorescent cell counter after treated with VCR. **P < 0.01 vs control group. |
Fig 2的TUNEL染色结果显示，对照组鱼体躯干部位显棕红色，可见圆形浅褐色皮肤细胞形态，有少数几个深褐色细胞; 0.02 mmol·L-1 VCR处理后，鱼体总体呈显深褐色，夹杂圆形褐色皮肤细胞形态，可以看出VCR主要损伤集中在皮肤层，深层组织褐色不明显; 褐色面积统计显示，大于0.02 mmol·L-1 VCR与空白对照组比较，差异均具有显著性(P < 0.01)，并且VCR引起褐色面积增加的效应具有剂量依赖性。
|
| Fig 2 TUNEL assay of VCR causes fluorescent cell ablation in (krt4:NTR-hKikGR) zebrafish A: Control Tg(krt4:NTR-hKikGR); B: Tg embryos were treated with 0.01 mmol·L-1 VCR; C: Tg embryos were treated with 0.02 mmol·L-1 VCR; D: Death skin cells of Tg zebrafish treated with 0.01~0.04 mmol·L-1 VCR. Black arrows indicate the apoptotic cells. **P<0.01 vs control group. |
Fig 3 Western blot结果显示，空白对照组caspase-3蛋白表达很低，VCR处理24 h后的斑马鱼caspase-3蛋白表达均升高，且具有剂量依赖性，0.01 mmol·L-1 VCR处理组与对照组比较差异具有显著性(P < 0.01)。
|
| Fig 3 Effect of VCR on caspase-3 expression in Tg (krt4:NTR-hKikGR) zebrafish **P < 0.01 vs control group |
如Fig 4所示，空白对照组p53蛋白有正常表达，VCR处理24 h后的斑马鱼p53蛋白表达逐步升高，且有剂量依赖性，0.02 mmol·L-1以上剂量处理组与对照组比较差异均具有显著性(P < 0.01)。
|
| Fig 4 Effect of VCR on p53 expression in Tg (krt4:NTR-hKikGR) zebrafish **P<0.01 vs control group |
如Fig 5所示，空白对照组KRT4蛋白表达较高，VCR处理24 h后的斑马鱼蛋白KRT4表达降低，且有剂量依赖性，0.02、0.04 mmol·L-1 VCR处理组与对照组比较，差异具有显著性(P < 0.01)。
|
| Fig 5 Effect of VCR on KRT4 expression in Tg (krt4:NTR-hKikGR) zebrafish **P<0.01 vs control group |
斑马鱼是当前具有广泛研究基础的模式动物，其全基因组测序已经完成[5]，以斑马鱼为载体已经建立了多个系统的疾病模型。成年哺乳动物的KRT4在口腔、食道、结肠等器官黏膜及上皮中广泛分布，在病理上与异常增生和癌变有关[6]。本实验采用的转基因斑马鱼(krt4:NTR-hKikGR)，其特征为在表皮细胞中角蛋白4上标记了绿色荧光蛋白，而使得每一个皮肤细胞都可显示在荧光显微镜下，当受到物理/化学的损伤时，受损部位细胞溶解可观察到荧光消失[7]，该转基因斑马鱼主要用于研究皮肤细胞损伤后及修复机制。斑马鱼胚胎在3 d内KRT4的表达主要集中在皮肤部位，因而此时KRT4的表达可以反映皮肤损伤的程度。
本实验选用长春新碱诱导模型皮肤细胞损伤，利用了VCR特异性抑制微管蛋白的特性。研究表明，长春新碱属于抑制微管蛋白合成类抗肿瘤药物，可使细胞停滞于有丝分裂中期[8]，该作用可能和VCR促进促凋亡蛋白Bax上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2下调有关[9]。本实验结果显示，低于0.04 mmol·L-1浓度的VCR是造成皮损的相对安全使用剂量，TUNEL和皮肤特征蛋白KRT4减少反映出VCR引起斑马鱼皮肤损伤主要集中在皮肤层。caspase-3是凋亡过程中重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[10]。VCR作用后caspase-3剂量依赖性地表达增加，表明鱼体程序性凋亡启动，其下游的caspase会加重皮肤损伤。p53与caspase-3均为细胞凋亡途径中的重要分子，p53表达增加直接引起细胞凋亡，也可以通过调节其他凋亡相关因子表达，间接导致细胞凋亡[11]。通过机制研究揭示了VCR不仅直接引起模型动物皮肤损伤的发生，而且下游的caspase-3等多通路凋亡途径激活，增加了斑马鱼皮肤细胞损伤。
综上所述，皮肤荧光斑马鱼皮肤损伤模型在国际上属新型动物模型，该模型能够满足在体高通量筛选要求，相对常用细胞损伤检测方法如流式细胞术、TUNEL法等，该模型具有较高的便利性：药物直接接触皮肤、皮肤带有荧光、镜下检测迅速、利用该转基因斑马鱼可快速完成皮肤损伤定量。因此，该模型可作为新皮肤损伤型疾病检测实验方法。作为完整的皮损模型仍需要进一步研究炎症在该过程中的作用，同时我们也将继续对VCR诱导皮肤细胞凋亡相关信号通路进行探索，为这一新高通量筛选模型的提供更多基础研究。
| [1] | 向振兰. 长春新碱外漏致皮肤损伤的护理与治疗(附3例报告)[J]. 山西医科大学学报, 1992(2): 183. Xiang Z L. Nursing and treatment of skin injury caused by veroic acid leakage of vincristine (Report of 3 cases)[J]. J Shanxi Med Univ, 1992(2): 183. |
| [2] | 孙小萍, 张水兰. 1例长春新碱外渗致皮肤损害患者的护理[J]. 河南大学学报, 2003, 22(1): 73-4. Sun X P, Zhang S L. Nursing of patients with skin injury induced by extravasation of vincristine[J]. J Henan Univ, 2003, 22(1): 73-4. |
| [3] | Rubinstein A L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery[J]. Curr Opin Drug Discov Devel, 2003, 6(2): 218-23. |
| [4] | Westerfield M, Wegner J, Jegalian B G. Specific activation of mammalian Hox promoters in mosaic transgenic zebrafish[J]. Genes Dev, 1992, 6(4): 591-8. doi:10.1101/gad.6.4.591 |
| [5] | Kerstin H, Matthew D C, Carlos F T, et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome[J]. Nature, 2013, 496(7446): 498-503. doi:10.1038/nature12111 |
| [6] | Chao S C, Tsai Y M, Yang M H, Lee J Y. A novel mutation in the keratin 4 gene causing white sponge naevus[J]. Br J Dermatol, 2003, 148(6): 1125-8. doi:10.1046/j.1365-2133.2003.05337.x |
| [7] | Chen C F, Chu C Y, Chen T H, et al. Establishment of a transgenic zebrafish line for superficial skin ablation and functional validation of apoptosis modulators in vivo[J]. PLoS One, 2011, 6: e20654. Date published: |
| [8] | Murray S W, Patricia L, Peter M K, et al. Preclinical pharmacology, toxicology and efficacy of sphingomyelin/cholesterol liposomal vincristine for therapeutic treatment of cancer[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1998, 42(6): 461-70. doi:10.1007/s002800050846 |
| [9] | 黄伟, 张瑶珍, 周剑锋, 等. 长春新碱对K562细胞plk1和γ-微管蛋白表达影响的研究[J]. 中国药理学通报, 2005, 21(3): 295-8. Huang W, Zhang Y Z, Zhou J F, et al. Study of influence of vincristine on plk1 and γ-tubulin in K562 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2005, 21(3): 295-8. |
| [10] | Stennicke H R, Salvesen G S. Properties of the caspases[J]. Biochim Biophys, 1998, 1387(1-2): 17-31. |
| [11] | Katiyar S K, Roy A M, Baliga M S. Silymarin induces apoptosis primarily through a p53-dependent pathway involving Bcl-2/Bax, cytochrome C release, and caspase activation[J]. Mol Cancer Ther, 2005, 4(2): 207-16. |
| [12] | Hideshima T, Mitsiades C, Akiyama M, et al. Molecular mechanisms mediating antimyeloma activity of proteasome inhibitor PS-341[J]. Blood, 2003, 101: 1530-4. doi:10.1182/blood-2002-08-2543 |