2. 湖南中医药大学 中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208
2. Key Lab of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardiocerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中约占60%~80%。缺血性脑卒中是由于脑部血液供应障碍，缺血缺氧引起脑组织坏死、软化，出现半身不遂、言语謇涩、口舌歪斜、偏身麻木等临床症状，甚至出现神志障碍。文献报道，女性在绝经后缺血性脑卒中发病率急剧上升[1]。随着人口老龄化进程的加快，进入绝经期女性人口增长速度也不断加快，世界卫生组织预计到2030年，全球将有12亿妇女进入绝经期，中国将超过2.1亿[2]。因此，研究绝经后缺血性脑卒中疾病的防治具有重要现实意义。本研究选用雌性大鼠双侧去卵巢术，术后再制备脑缺血模型，模拟绝经后脑缺血，观察加味脑泰方对去势脑缺血模型大鼠的脑损伤及雌激素水平的影响，以及两者的相关性。
1 材料 1.1 实验动物96只SD大鼠，♀，体质量(220±20)g，清洁级，8周龄，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号: SCXK(湘)2013-0004，符合清洁级实验动物标准，常规标准饲料分笼喂养。
1.2 药物的制备加味脑泰方由黄芪20 g、墨旱莲15 g、女贞子10 g、地龙10 g、僵蚕10 g、川芎5 g组成。中药复方经湖南中医药大学湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室经水煎煮浓缩，冷冻备用，临用时以生理盐水配成低、中、高剂量(6、12、24 g·kg-1)灌胃。17β-雌二醇，购自湖南中医药大学第一附属医院。大鼠每次灌胃容量10 mL·kg-1，每天1次。
1.3 试剂与仪器水合氯醛(国药集团); 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC, Sigma公司); 雌激素ELISA试剂盒(江莱生物)。线栓(2636 A4，北京西浓); 酶标仪(美国BioTek公司); Motic-BA400显微镜(日本Olympus公司)。
2 方法 2.1 动物模型的制备 2.1.1 去势模型的制备参照文献[3]，去势组、模型组、药物组大鼠术前禁食12 h，用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，在无菌条件下迅速于背部两侧剪开约3 cm切口，扎紧输卵管后切除卵巢，缝合切口。假手术组于背部剪开切口后直接缝合。手术后腹腔注射青霉素3 d。
2.1.2 脑缺血模型的制备参照文献[4]建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，将去势模型成功的模型组、脑缺血组、药物组大鼠禁食12 h，用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，颈部正中切开皮肤，钝性分离，暴露右颈总动脉，分离颈内动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉近心端及远心端。将鱼线插入颈内动脉，插入深度约(18.5±0.5)mm，至微感阻力，固定线栓，逐层缝合。术后24 h参考Longa的五分制法进行神经功能评分[5]。假手术组仅切开皮肤、分离右颈总动脉后即缝合。
2.2 动物分组与给药将大鼠随机分为假手术组(A)、去势组(B)、脑缺血组(C)、模型组(去势+脑缺血, D组)、药物组(加味脑泰方高、中、低剂量组，简称E、F、G组; 雌激素组，H组)。动物适应3 d后，行去卵巢手术制备去势模型，术后d 5开始每天取其阴道分泌物涂片，每天1次，连续5 d，以不出现动情周期反应确定造模成功。术后d 11药物组分别给予相应药物灌胃，连续灌胃3 d; 假手术组、脑缺血组、模型组灌胃等量生理盐水。术后d 14，脑缺血组，模型组、药物组制备脑缺血模型。
2.3 标本的采集与处理各组大鼠于脑缺血造模24 h后, 用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，取腹主动脉血5 mL于试管中，混匀、离心，分离血清，置-80℃低温冰箱中保存备用。缺血后立即备皮消毒后，断头，冰盒上分离大脑，取脑组织。
2.4 TTC染色快速取出大脑，冠状切成5片, 每片厚约2~3 mm, 放于2%的TTC溶液中染色，将染色后的脑组织浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定2 h, 应用医学图像分析系统测量各组大鼠大脑的梗死面积。
2.5 神经元细胞形态的观察大鼠脑组织经4%多聚甲酸固定48 h, 常规石蜡包埋, 连续切片, 备用，用HE染色法观察细胞形态的变化。
2.6 雌激素水平的测定ELISA法测定血清E2含量变化，按试剂盒说明书操作。
2.7 统计学分析所有数据均用SPSS 17.0软件进行处理。多组组间比较，如方差齐时选择LSD法，方差不齐选择Dunnett T3法进行方差分析; 两变量相关性采用Pearson相关分析。
3 结果 3.1 加味脑泰方对去势脑缺血大鼠脑梗死面积的影响Fig 1、2显示，去势脑缺血模型组大鼠脑梗死面积比脑缺血组、假手术组明显增大，给予加味脑泰方、雌激素干预后，能明显使模型组大鼠脑梗死面积减少(P < 0.01或P < 0.05)。雌激素组脑梗死面积比加味脑泰方组均小，尤其比加味脑泰方低剂量组明显减少(P < 0.05)。
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| Fig 1 Coronal sections of TTC-stained brains A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group |
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| Fig 2 Effect of Jiawei Naotaifang on area of cerebral infarction in ovariectomized rats with cerebral ischemia(x±s) A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. ▲▲P<0.01 vs group A; ##P<0.01 vs group D; **P<0.01 vs group H. |
如Fig 3所示，假手术组皮质细胞核清晰，细胞大小、形态正常，排列整齐，核仁可见，胞核着色均匀，细胞间质染色均匀。去势组有少量皮质细胞固缩。脑缺血组出现细胞体积缩小，大量细胞坏死，细胞核固缩深染，有部分细胞水肿体积增大，形态不规则，细胞间隙增大。模型组皮质细胞基本坏死、细胞核固缩，细胞间隙明显增大。加味脑泰方低剂量组细胞固缩、水肿明显，细胞核不清晰，核仁不明显。雌激素组、加味脑泰方高、中剂量组均存在皮质细胞坏死、细胞固缩，组间细胞形态相似，无明显细胞水肿，比模型组明显减少。
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| Fig 3 Cortical cell morphology in ovariectomized rats with cerebral ischemia(×400) A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. →: Nuclear pyknosis and nuclear staining. |
如Fig 4所示，假手术组海马细胞形态正常，细胞轮廓清晰可见，细胞排列整齐。去势组有极少量海马细胞皱缩，胞核固缩，其余与假手术组相似。脑缺血组、模型组、加味脑泰方低剂量组均出现大量海马细胞坏死，细胞皱缩，胞核固缩明显、深染变性，以模型组更明显。雌激素组、加味脑泰方高、中剂量组海马细胞皱缩、胞核固缩比模型组少，其中以加味脑泰方高剂量组改善更明显。
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| Fig 4 Hippocampal cell morphology in ovariectomized rats with cerebral ischemia(×400) A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. →: Nuclear pyknosis and nuclear staining. |
如Fig 5所示，与假手术组比较，模型组的雌激素水平明显降低，比脑缺血及去势组均低(P < 0.01);而分别给予加味脑泰方、雌激素干预后，雌激素水平明显高于模型组，但雌激素组的雌激素水平明显高于加味脑泰方组(P < 0.01或P < 0.05)。
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| Fig 5 Effect of Jiawei Naotaifang on estrogen level in ovariectomized rats with cerebral ischemia(x±s) A: Sham group; B: Ovx group; C: MCAO group; D: Model group; E: Jiawei Naotaifang high dose group; F: Jiawei Naotaifang middle dose group; G: Jiawei Naotaifang low dose group; H: Estrogen group. ▲▲P<0.01 vs group A; #P-0.05, ##P<0.01 vs group D; **P<0.01 vs group H. |
相关性分析结果表明，脑缺血组、模型组、雌激素组、加味脑泰方组大鼠雌激素水平与脑梗死面积呈明显负相关(r=-0.676，P=0.000)。
4 结论目前研究发现，脑梗死发病率男性发病率高于女性，但随年龄的增长，不同性别的发病率差异缩小[6-8]。文献报道，在成年女性的缺血损伤比同龄男性患者轻[9]，而在更年期、绝经后或卵巢切除手术后，内源性雌二醇损失可导致中风的风险增加[10-11]，并发现内源性雌激素水平与女性脑卒中严重程度、时期(急性期)、短期死亡率及预后相关[12]。本研究结果发现，去卵巢后大鼠的脑缺血脑梗死面积比未去卵巢大鼠的明显大、神经细胞坏死更多，固缩更明显，细胞轮廓、界限不清晰; 雌激素水平也更低，与文献报道一致[12-13]; 脑梗死面积与雌激素水平呈明显相关。这提示去卵巢后脑缺血比未去卵巢大鼠的脑缺血更严重，雌激素水平与脑梗死发生、脑损伤程度密切相关，也可能是女性发生脑梗死的脑保护因素之一。
在治疗方面，临床上并没有因为性别不同而采取不同的防治措施。女性缺血性中风在绝经后发病率明显增高，此时患者因气虚、无力推动血行，气滞血瘀，而气虚不能化生血液，可导致血虚，阴血虚脉道不充，血气不旺，血行迂缓，易于凝聚成瘀，血阻经络、脑窍而成，故以气虚血瘀为病机根本，兼有阴虚血，故在益气活血的基础上辅助以补阴血的作用。加味脑泰方在脑泰方基础上加以女贞子、墨旱莲。实验证实了脑泰方能保护脑缺血引起的损伤[14]。本方以黄芪为君药，大补脾胃元气，令气旺则血活，血活则瘀除，以治其本; 墨旱莲养阴清热为臣药; 佐以女贞子补益肝肾，助墨旱莲滋补阴液，并防温药伤阴; 僵蚕息风止痉祛痰，地龙平肝熄风通络利水，僵蚕与地龙为佐药，息风止痉，又能通络有利气、血运行; 川芎活血行气，善上行头目，为血中之气药，此药引药上达于脑为使药。本实验结果显示，加味脑泰方能提高雌激素水平、降低脑梗死面积、改善神经细胞损伤，而雌激素水平与脑梗死面积呈负相关，这是否与加味脑泰方通过提高雌激素水平减轻脑损伤有关，有待进一步研究。
( 致谢: 本实验主要在湖南中医药大学第一附属医院中心实验室及中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室完成，感谢实验室及课题组老师和同学的帮助 )
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