2. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004;
3. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004;
4. 国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004
2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Ministry of Education, Guiyang 550004, China;
3. School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China;
4. National Engineering Research Center of Miao's Medicines, Guiyang 550004, China
艾迪注射液(Aidi injection，ADI)为《国家基本医疗药物目录》品种，也是贵州省名优注射剂大品种，由斑蝥、人参、黄芪、刺五加组成，具有清热解毒、消瘀散结功能[1]。斑蝥为君药，也是抑制肿瘤细胞的有效成分[2]; 人参、黄芪、刺五加为佐药，具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成等多方面协同抗肿瘤作用[3-5]。ADI在治疗恶性肿瘤时，通常与阿霉素(doxorubicin, DOX)、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、羟基喜树碱等化疗药物联合使用[6-8]。2016年，ADI销售额近20亿元，已成为临床抗肿瘤中药的常用药物。DOX又称多柔比星，为蒽醌类抗肿瘤药，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗癌谱较广[9]，其机制主要是通过产生氧自由基、脂质过氧化作用，导致细胞凋亡。但临床上DOX易引起严重心脏毒性[10]，这是DOX及其活性代谢产物阿霉素醇(doxorubicinol, DOXol)共同的药理作用结果[11]。因此，本研究将考察ADI与DOX联合用药，是否影响DOX体内药代动力学过程，这对促进DOX临床合理配伍用药，保证用药的有效性和安全性有重要意义。
1 材料 1.1 仪器超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(ACQUITY UPLC，美国沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、电喷雾三重四级质谱仪、Masslynx 4.1质谱工作站); Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司); EL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司); MTN-2800D氮吹浓缩装置(奥特塞恩斯仪器公司)。
1.2 药物与试剂艾迪注射液(批号20150627，规格10 mL/支)由贵州益佰制药有限责任公司提供; 盐酸阿霉素(纯度＞98%，批号：25316-40-9)、盐酸托烷司琼对照品(纯度＞98%，批号：105826-92-4)均购自大连美仑生物科技有限公司; 阿霉素醇对照品(纯度＞98%，批号：54193-28-1)购于加拿大TRC; 色谱甲醇和乙腈(德国Merck公司); 实验用水为超纯水; 其余溶剂均为分析纯。
1.3 实验动物健康SD大鼠，♂，体质量180~200 g，SPF级，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK (湘) 2014-0011。动物饲养于(22±2)℃、相对湿度(60 ± 10)%的环境中，饲养管理均严格按照实验动物的要求及规则，实验前饲养1周适应环境。
2 方法 2.1 标准溶液配制DOX标准溶液：称取DOX对照品5.1 mg，加入适量甲醇超声，使其溶解并定容至10 mL，得0.51 g·L-1的DOX储备液，-20℃保存。DOXol标准品溶液：DOXol对照品规格为每支1 mg，加入1 mL甲醇，超声使其溶解，得0.1 g·L-1的DOXol储备液，-20℃保存。托烷司琼内标溶液：称取托烷司琼10.2 mg，甲醇超声溶解并定容至10 mL，得浓度为1.02 g·L-1的储备液，再逐级稀释至浓度为50 μg·L-1的内标溶液，-20℃保存。
2.2 分组给药及样品采集SD大鼠随机分成联合用药组和单独用药组，每组6只，实验前禁食1夜，自由饮水。联合给药组连续腹腔注射ADI 14 d (10 mL·kg-1)，于d 15尾静脉注射DOX (7 mg·kg-1)，单独给药组连续腹腔注射相同时间、同等体积的生理盐水，于d 15尾静脉注射相同剂量的DOX。两组大鼠给药后2、5、10、15、20、30 min及1、2、4、8、12、24、36 h经右侧尾静脉取血约0.3 mL，置于涂有肝素钠的离心管中，6 000 r·min-1离心3 min，分离血浆，于-20℃储存。
2.3 血浆处理方法准确吸取血浆100 μL，加50 μL托烷司琼内标溶液(50 μg·L-1)，涡混1 min，加入含5%甲酸的甲醇溶液450 μL，涡混3 min，超声5 min，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液于40℃空气吹干，残渣用400 μL 50%甲醇溶液溶解，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液1 μL进样，进行UPLC-MS分析。
2.4 UPLC-MS液质条件 2.4.1 UPLC色谱条件Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱; 柱温45℃; 流动相0.1 %甲酸乙腈(a)-0.1 %甲酸水(b); 0~0.5 min 10%~30 % a，0.5~1.5 min 30%~60 % a，1.5~2.0 min 60%~90% a，2.0~3.0 min 10% a; 流速0.35 mL·min-1。
2.4.2 质谱条件采用电喷雾(ESI)离子源，在正离子电离模式下为选择离子监测模式(selected or single ion recording, SIR)的质谱扫描方式进行测定，DOX、DOXol、托烷司琼(IS)的质荷比(m/z)分别为544.3、546.3、285.3;三者锥孔电压分别为20 V、20 V、32 V。其他具体质谱参数：毛细管电压3 kV，离子源温度120℃，去溶剂气(N2)650 L·h-1，去溶剂气温度350℃，碰撞气(氩气)0.16 mL·min-1。
2.5 方法学考察 2.5.1 专属性取大鼠的空白血浆100 μL，不加内标，空白血浆加入混合标准溶液和内标，静脉注射DOX 10 min的血浆样品，按照“2.3”处理。
2.5.2 线性取系列不同浓度的混合标准溶液(DOX、DOXol)和内标各50 μL，加入100 μL的空白血浆，同“2.3”项下操作处理后进样分析。以待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物质浓度(c)为横坐标X用加权最小二乘法进行线性回归，权重系数为1/X，求得标准曲线。
2.5.3 回收率与基质效应取100 μL空白血浆分别配制含DOX、DOXol的低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，每个浓度平行6份，按“2.3”项下操作(A样品)。另取空白血浆，除不加混合标准溶液与内标外，其余按“2.3”项下操作，向获得的上清液中加入相应3个浓度的混合标准溶液和内标(B样品); 另取上述3个浓度的混合标准溶液与内标，以400 μL初始流动相溶解(C样品)。A样品与B样品色谱峰面积之比为提取回收率，B样品与C样品的色谱峰面积之比为基质效应。
2.5.4 精密度与准确度按“2.5.2”项下分别配制含有DOX、DOXol的低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，各成分浓度分别平行处理6份，连续测定3 d，与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，评价方法的准确度与日内、日间精密度。
2.5.5 稳定性按“2.5.2”项下分别配制低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，样品处理后置于自动进样器中，在0、12 h分别进样分析; 同法配制低、中、高3个浓度QC样品，分别4℃下冷藏24 h，反复冻融3次后进样分析，考察大鼠血浆样品中DOX与DOXol在室温和冷藏不同时间下的稳定性，每一浓度6个样本分析。
3 结果 3.1 专属性取大鼠的空白血浆100 μL，按照“2.3”处理(不加内标)，得色谱图Fig 1A; 空白血浆加入混合标准溶液和内标，按“2.3”项下操作，得到色谱图Fig 1B。静脉注射DOX 10 min的血浆样品，按照“2.3”处理，得色谱图Fig 1C。结果显示，血浆内源性物质不干扰DOX、DOXol与托烷司琼(IS)。
|
| Fig 1 Typical chromatograms of plasma (A), plasma spiked with the mixed standard solution and IS(B), and rat plasma sample collected at 10min after intravenous administration of doxorubicin (C) 1: Tropisetron; 2: Doxorubicinol; 3: Doxorubicin |
DOX的标准曲线为Y=0.1923X-0.0029，R2=0.9999(0.10~256.01 mg·L-1)，DOXol的标准曲线为Y=0.1738X-0.0019，R2=0.9987(0.01~24.97 mg·L-1)。
3.3 回收率与基质效应DOX与DOXol低、中、高3个浓度的质控样品的回收率范围为84.19%~100.94%，基质效应范围为91.62%~99.22%。实验结果表明，DOX与DOXol提取回收率良好，无明显的基质效应(Tab 1)。
| Group | Concentration/mg·L-1 | Recovery/% | RSD/% | Matrix effect/% | RSD/% |
| DOX | 0.102 | 96.37±5.13 | 5.32 | 91.62±3.57 | 3.90 |
| 25.60 | 99.06±3.67 | 3.70 | 96.86±1.76 | 1.82 | |
| 256.01 | 100.94±0.91 | 0.90 | 95.69±1.89 | 1.98 | |
| DOXol | 0.05 | 84.19±8.22 | 9.76 | 93.30±9.07 | 9.72 |
| 2.50 | 89.40±4.68 | 5.23 | 93.29±6.31 | 6.76 | |
| 24.97 | 92.19±7.68 | 8.33 | 97.93±7.34 | 7.50 |
Tab 2结果表明，DOX与DOXol的准确度范围>80%，日内和日间精密度RSD均小于10.0%，提示该方法准确、可靠、重现性较好。
| Group | Concentrationof QC/mg·L-1 | Accuracy/% | Inter-dayprecision RSD/% | Intra-day precision RSD/% |
| DOX | 0.102 | 88.11±1.39 | 1.58 | 1.38 |
| 25.60 | 95.94±3.61 | 3.76 | 4.09 | |
| 256.01 | 96.58±1.90 | 1.97 | 2.63 | |
| DOXol | 0.05 | 83.25±8.13 | 9.77 | 9.81 |
| 2.50 | 87.09±4.55 | 5.22 | 8.35 | |
| 24.97 | 91.47±7.62 | 8.33 | 7.60 |
各浓度下的QC样品在自动进样器中放置12 h，4℃冷藏24 h，反复冻融3次后，稳定性结果见Tab 3。结果表明，DOX与DOXol在上述条件下在血浆中均能保持稳定。
| Group | Concentration/mg·L-1 | Autosampler 0 h | Autosampler 12 h | Frozen storage 24 h | Freezing and thawing 3 times |
| DOX | 0.102 | 0.12±0.01 | 0.13±0.02 | 0.13±0.01 | 0.11±0.01 |
| 25.60 | 25.45±0.78 | 25.65±0.24 | 25.92±0.31 | 25.11±0.48 | |
| 256.01 | 256.00±15.92 | 256.68±15.53 | 257.35±15.18 | 250.62±6.08 | |
| DOXol | 0.05 | 0.05±0.01 | 0.05±0.01 | 0.04±0.01 | 0.04±0.01 |
| 2.50 | 2.42±0.04 | 2.39±0.19 | 2.39±0.24 | 2.37±0.08 | |
| 24.97 | 24.17±1.36 | 23.16±1.06 | 23.09±2.29 | 22.96±1.28 |
测定出血药浓度后，采用DAS 2.0药代动力学软件计算药代动力学参数和房室模型。两组大鼠血浆中DOX和DOXol的血药浓度随时间变化情况及C-t曲线见Tab 4、Fig 2，DOX主要药代动力学参数结果见Tab 5，结果表明两组大鼠体内DOX和DOXol无明显差异。
| Time/h | DOX/mg·L-1 | DOXol/mg·L-1 | |||
| Single group | Combination group | Single group | Combination group | ||
| 0.033 | 26.72±3.58 | 30.22±15.30 | 0.43±0.07 | 0.39±0.05 | |
| 0.083 | 9.19±1.78 | 13.02±6.63 | 0.52±0.08 | 0.47±0.06 | |
| 0.167 | 2.67±1.14 | 5.34±2.63 | 0.68±0.10 | 0.63±0.08 | |
| 0.250 | 1.51±0.64 | 2.39±1.38 | 0.85±0.09 | 0.80±0.09 | |
| 0.333 | 0.95±0.50 | 1.44±0.80 | 0.96±0.15 | 0.92±0.16 | |
| 0.5 | 0.60±0.28 | 0.68±0.13 | 0.66±0.23 | 0.59±0.10 | |
| 1 | 0.44±0.17 | 0.43±0.02 | 0.46±0.19 | 0.43±0.12 | |
| 2 | 0.33±0.12 | 0.33±0.04 | 0.25±0.28 | 0.22±0.17 | |
| 4 | 0.23±0.01 | 0.22±0.02 | 0.15±0.34 | 0.15±0.33 | |
| 8 | 0.18±0.01 | 0.18±0.01 | 0.11±0.06 | 0.09±0.03 | |
| 12 | 0.17±0.01 | 0.16±0.02 | 0.07±0.02 | 0.06±0.02 | |
| 24 | 0.15±0.01 | 0.15±0.01 | 0.05±0.01 | 0.05±0.01 | |
| 36 | 0.14±0.01 | 0.14±0.01 | 0.04±0.01 | 0.04±0.01 | |
|
| Fig 2 DOX and DOXol concentrations in rat plasma after intravenous administration of 7 mg·kg-1 doxorubicin (n=6) |
| Parameter | Unit | Single group | Combination group |
| T1/2α | h | 0.029±0.002 | 0.033±0.011 |
| T1/2β | h | 0.456±0.274 | 0.676±0.653 |
| V1 | L·kg-1 | 0.124±0.018 | 0.177±0.12 |
| CL | L·h-1·kg-1 | 1.384±0.245 | 1.308±0.547 |
| AUC(0-t) | mg·L-1·h-1 | 4.00±0.77 | 4.835±1.878 |
| AUC(0-∞) | mg·L-1·h-1 | 5.20±0.94 | 6.182±2.439 |
| K10 | h-1 | 11.19±1.22 | 8.746±2.569 |
| K12 | h-1 | 12.51±2.16 | 12.529±7.303 |
| K21 | h-1 | 3.04±1.72 | 6.841±6.446 |
本研究前期考察了大鼠血浆样品前处理方法，包括有机溶剂蛋白沉淀(甲醇、乙腈沉淀蛋白)、液液萃取(乙酸乙酯)、固相萃取等多种样品处理方法，发现采用甲醇沉淀蛋白的方法，简单、易行，且回收率能满足生物样品的分析要求，因此，选用甲醇沉淀蛋白的方法处理样品。另外，考察了5%甲酸、10%甲酸、5% NaOH、10% NaOH溶液条件对DOX与DOXol提取回收率的影响。DOX和DOXol为多羟基化合物，样品处理过程中加入一定量酸进行酸化，可以提高UPLC-MS检测灵敏度，而加入碱会使得DOX不稳定(溶液变深紫色)，因此，采用含5%甲酸的甲醇溶液进行蛋白沉淀处理，并及时涡旋、混匀，防止形成的蛋白沉淀包裹待测成分。由于生物样品中待测成分浓度低，血浆基质干扰大，因此，优化样品检测的质谱检测条件就变得尤为重要[12]。参考相关文献[13-14]方法，优化各待测离子的锥孔电压、离子源温度、毛细管电压等参数，最终确定了实验的质谱条件，同时，检测1个血浆样品中的DOX和DOXol仅需3 min，最大程度缩减了样品分析时间，真正实现高通量分析。
临床上，阿霉素用于化疗时，成人常用量为1次50~60 mg，每3~4周1次，相当于大鼠7 mg·kg-1的给药剂量。根据ADI药品说明书，1次使用剂量为50~100 mL，加入0.9%氯化钠注射液或5%~10%葡萄糖注射液中静脉滴注，15 d为一周期，对晚期恶病质病人，连用30 d为1个疗程，或视病情而定，因此，本实验考察了ADI连续使用14 d后对DOX的药代动力学的影响。结果表明，DOX与ADI联合给药后，DOX的药代动力学行为及其活性代谢产物DOXol无明显改变，说明连续使用ADI对参与DOX代谢生成DOXol的药物代谢酶无明显影响。其中，羰基还原酶1(CBR1)是肝脏中参与DOX代谢生成DOXol的关键性酶[15]。从本实验结果可以推测，ADI对CBR1无明显影响。后期，本课题组通过Western blot技术也证实了两组大鼠肝脏中CBR1的蛋白表达无明显差异(表达结果无差异，因而未放入文中)。
综上所述，本研究建立了快速检测血浆中DOX和DOXol的分析方法，通过考察ADI对DOX和DOXol药代动力学的影响，提示临床上两者联合用药，ADI可能不会引起DOX血药浓度过高而导致药物不良反应。
( 致谢: 本实验由“贵州省药物制剂重点实验室”和“民族药与中药开发应用教育部工程研究中心”共同努力下完成。)
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