2. 军事认知与脑科学研究所，北京 100850
2. Institute of Military Cognitive and Brain, Beijing 100850, China
小肠是对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤最敏感的器官，在失血性休克、创伤等情况下，均不可避免地会造成小肠的缺血性损伤，在解除或缓解缺血损伤的过程中，又会造成I/R损伤[1]。I/R损伤的病理生理机制十分复杂，涉及氧自由基损伤、白细胞黏附浸润、炎症介质释放、能量代谢障碍等多方面因素的参与[2-3]。肠道I/R不仅损害肠道本身，还会引发全身炎症反应综合征、多脏器功能不全综合征等[4]，是造成重伤伤员康复率、生存率低的重要因素之一。目前，临床主要采用抗能量衰竭[5]、调控巨噬细胞激活转变[6]、抑制氧自由基[7]等药物治疗肠I/R损伤，但这些药物的疗效并不是很理想，I/R损伤的死亡率并未得到有效改善。因此，研究者们有必要进一步探究肠I/R损伤的发病机制，并努力研发出疗效更好、安全性更高的药物，进而达到抑制继发症发生、改善预后、提高存活率的目的。许多研究发现，炎症反应在肠I/R损伤的发生和发展过程中至关重要。白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)是一种重要的促炎因子，生物学效用广泛，可激活淋巴细胞，上调免疫功能，促进其他炎性细胞因子表达，诱导中性粒细胞浸润，刺激细胞增殖等[8]。白介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)是天然抗炎因子，与IL-1竞争性结合细胞膜上的IL-1受体，从而拮抗IL-1信号传递，阻断其生物学功能，在调节免疫、抑制炎症方面发挥重要作用[9]。
肠道是自由基产生最为丰富的组织，肠I/R时，黄嘌呤氧化酶系统活性增强，线粒体功能受损，产生大量氧自由基。氧自由基不仅会通过氧化损伤蛋白质、脂质与DNA，从而直接破坏细胞，并且会激活多条信号通路，增加促炎因子、转录因子等的表达，从而诱导、调节细胞的凋亡和坏死[10]。有研究表明，IL-1Ra具有一定的清除自由基和增强内源性抗氧化系统的能力，对氧化应激损伤具有一定的治疗作用，可缓解脑、卵巢等多种器官的I/R损伤诱发的氧化应激[11-13]，但其对肠I/R损伤是否具有防治作用尚不清楚。本研究通过夹闭肠系膜上动脉制备肠I/R损伤大鼠模型，探讨IL-1Ra对大鼠肠I/R后的肠损伤是否具有保护作用，为IL-1Ra的临床应用提供理论和实践依据。
1 材料 1.1 实验动物♂ SD大鼠35只，体质量245~265 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0011。在每天光照12 h环境中饲养2周。
1.2 重组蛋白的制备以本研究室保存的PBV220IL-1Ra cDNA重组表达质粒，进行工程菌培养和诱导表达，获得含该蛋白的大量表达菌体，最后经阴、阳离子交换层析和纯化，制备IL-1Ra蛋白。
1.3 试剂肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(ERC102a)、IL-1β ELISA试剂盒(ERC007)、IL-6 ELISA试剂盒(ERC003)，均购自欣博盛生物科技公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)试剂盒，均购自南京建成生物工程公司；RIPA裂解液(01408)、BCA蛋白定量试剂盒(CW0014S)，均购自北京康为世纪公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自罗氏生物公司。
1.4 仪器Mode1550酶标仪、蛋白纯化系统Biologic Duo-Flow System (Bio-Rad公司)；DU640紫外分光光度计(美国Beckman公司)；3K18高速低温离心机(美国Sigma公司)；GeneAmp PCR system 2700DNA扩增仪(Bio-Rad公司)；URP Imagestore 7500凝胶成像分析系统(VILBER公司)；BIOFLO Ⅲ发酵罐，LS-B高压灭菌器，阴、阳离子色谱分离层析柱Hit rap QFF，Hit rap SPFF (GE Healthcare公司)；FPLC纯化仪(AKTA公司)。
2 方法 2.1 动物模型的制备及实验分组动物于实验前禁食12 h，正常饮水。2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，上腹正中部位开腹，暴露肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)后，分离SMA并用动脉夹夹闭其根部造成缺血，1 h后取下动脉夹，使血流再灌注1 h。实验结束后处死，距回盲结5 cm取小肠，生理盐水清洗后，部分置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分-70℃保存。
实验大鼠随机分成5组：假手术(S)组、模型(I/R)组、10 mg·kg-1 IL-1Ra+ I/R (C1)组、20 mg· kg-1 IL-1Ra+ I/R(C2)组、50 mg·kg-1 IL-1Ra+ I/R(C3)组。S组开腹后只分离SMA；I/R组夹闭SMA 1 h后再灌注1 h；C1、C2、C3给药组手术同I/R组，在松夹前15 min尾静脉注射不同剂量的IL-1Ra。
2.2 肠组织损伤评分4%多聚甲醛中固定的小肠组织经脱水、透明、石蜡包埋后，制成2~3 μm组织切片后，经苏木精-伊红(HE)染色，分别在100倍和400倍显微镜下随机选5个非重叠视野观察肠黏膜病理学改变。用Chiu氏法对肠组织病理损伤进行评分，取平均值用于统计[14]，评分标准参见Tab 1。
| score | classification | standard |
| 1 | 0 | Normal mucosal villi |
| 2 | 1 | Form a gap in the middle axis of the villi, often withcapillary congestion |
| 3 | 2 | Extension of the subepithelial space with lifting of the epithelial layer from the lamina propria |
| 4 | 3 | Massive epithelial lifting down the sides of villi possibly with a few denuded tips |
| 5 | 4 | Denuded villi with the lamina propria and dilated capillaries exposed with possible increased cellularity of the lamina propria. |
| 6 | 5 | Digestion and disintegration of the lamina propria and presence of hemorrhage and ulceration |
取10%肠组织，室温解冻后匀浆，依照MPO试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在460 nm处测定吸光度，计算MPO活性。
2.4 肠组织匀浆IL-1β、IL-6、TNF-α的含量检测取10%肠组织，室温解冻后匀浆，分别按ELISA试剂盒说明书进行操作，计算小肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。
2.5 肠组织SOD和MDA检测取10%肠组织匀浆，用生理盐水稀释成1%组织匀浆液后，按SOD试剂盒说明，采用黄嘌呤氧化酶法测定组织中SOD活性。
2.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计学软件对实验数据进行分析，结果以x±s表示，采用单因素方差分析，多组计量资料方差齐性，两两比较采用Bonfferoni检验。图形绘制应用Graphpad Prism6软件。
3 结果 3.1 IL-1Ra蛋白制备将含有PV220/IL-1Ra重组表达质粒的工程菌进行培养，并诱导表达重组蛋白。随后经过阴、阳离子交换层析和纯化，制备了IL-Ra重组蛋白，纯度>90 %(Fig 1)。
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| Fig 1 Purified IL-1Ra recombinant protein M: Protein relative molecular mass markers; IL-1Ra: The recombinant protein prepared from purification |
肠组织石蜡切片经HE染色，分别在100倍和400倍光镜下观察，S组大鼠未见明显病理改变, 绒毛顶端上皮微有脱落。I/R组可见明显上皮细胞和绒毛顶端上皮脱落，固有层崩解，可见散在的出血灶和溃疡，腺体明显受损。应用IL-1Ra后, 大鼠肠黏膜损伤均明显减轻，C2组大鼠黏膜仅有轻度损伤，绒毛上皮细胞结构完整，未见毛细血管和淋巴管扩张。分别在100倍和400倍显微镜下随机选5个非重叠视野观察，根据Chiu氏评分标准，对不同组大鼠的肠组织损伤进行分级评分后，取平均值用于统计分析。结果显示，I/R 2 h后，I/R组小肠组织受损严重，与S组相比，差异具有显著性。而不同剂量给药组大鼠的肠组织损伤程度较模型组均有所改善，20 mg·kg-1给药组疗效最佳(Fig 2)。
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| Fig 2 Histopathological changes of intestinal mucosa and evaluation of intestinal injury with Chiu's scores (x±s, n=7) A: Histopathological pictures; B: Intestine injury score. ##P < 0.01 vs S group; **P < 0.01 vs I/R group; △△P < 0.01 vs C2 group; ▲▲P < 0.01 vs C1 group |
大鼠经I/R处理后，相比于S组，I/R组的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显上升，再灌注前15 min尾静脉给药后，大鼠的小肠组织中上述炎症因子含量均下降，C1、C2给药组与I/R组相比，差异尤为明显(Fig 3)。
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| Fig 3 Effects of IL-1Ra on contents of IL-1β(A), IL-6(B), TNF-α(C) (x±s, n=7) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs S group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs I/R group |
I/R 2 h后，I/R组大鼠的中性粒细胞标志物MPO指标明显上升，表明有大量中性粒细胞在肠组织聚集并活化，促进炎症反应。而尾静脉注射给药后，MPO含量下降，中性粒细的浸润得以缓解(Fig 4)。
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| Fig 4 Effects of IL-1Ra on contents of neutrophile granulocyte(x±s, n=7) ##P < 0.01 vs S group; **P < 0.01 vs I/R group |
如Fig 5所示，I/R组与假手术S组相比，肠组织中抗氧化酶SOD被大量消耗，活力明显降低；肠组织中脂质过氧化产物MDA水平明显增加。给药治疗后，与I/R组相比，给药组大鼠SOD活性有所增高，MDA含量有不同程度的降低，C2组治疗效果明显。
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| Fig 5 Effects of IL-1Ra on contents of SOD(A) and MDA(B) (x±s, n=7) ##P < 0.01 vs S group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs I/R group; △△P < 0.01 vs C2 group |
IL-Ra是体内天然存在的抗炎因子，通过竞争性拮抗IL-1与膜上IL-1受体结合，阻断IL-1发挥生物活性。2001年被美国FDA批准用于临床治疗类风湿性关节炎，同时，大量研究表明，其对于化疗性肠炎、败血症性休克、脑中风、哮喘[15]等疾病诱发的炎症也有很好的治疗作用。本实验采用动脉夹夹闭肠系膜上动脉1 h，松开动脉夹恢复血流灌注制备了大鼠肠I/R模型，在再灌注前15 min尾静脉注射3个不同剂量的IL-Ra，探究IL-1Ra对肠I/R损伤的作用。结果发现，相比于I/R组，IL-Ra不同给药剂量组的炎症因子、MPO、SOD、MDA及Chui氏评分指标均有所改善，差异具有显著性。表明IL-Ra可有效抑制氧化应激和炎症反应，对肠I/R诱导的损伤具有很好的保护作用。
最新研究发现，IL-Ra对一些疾病伴随的氧化应激具有一定的抑制作用[11-13]。本实验研究结果显示，IL-Ra给药组大鼠肠组织氧化应激指标与模型组相比有明显改善，进一步表明IL-Ra对肠I/R损伤诱发的氧化应激同样也具有抑制作用。至于IL-Ra抑制氧化应激的作用机制，目前还未有明确的阐述。IL-Ra竞争性结合IL-1R，阻断IL-1作用于NF-κB和MAPK信号通路，我们推测其对氧化应激的抑制作用很可能与NF-κB和MAPK信号转导有关，具体作用机制有待进一步研究。
分析本实验结果发现，IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO 4个炎性指标，高剂量C3组比中剂量C2组均略高，但差异都没有统计学意义，而高剂量组和中剂量组的SOD变化情况则基本一致，只有肠组织损伤评分和MDA指标，C2和C3组比较有较大差异。这可能是因为IL-1Ra在作用部位的浓度远高于IL-1后，拮抗阻断IL-1的生物学作用达到饱和，继续增加IL-1Ra给药剂量，其拮抗作用不会随之增强，即文中SOD指标基本无变化，IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO检测指标差异无显著性。本实验只是初步研究了IL-1Ra对大鼠肠I/R诱导的肠损伤的保护作用，由于手术过程的繁琐，本次实验组只制备了7只大鼠，动物实验只数较少，同时，实验动物存在个体差异，可能出现高剂量组MDA值和组织损伤评分略高于中剂量组，但与I/R组相比，IL-1Ra高、中剂量组均能很好地降低MDA和组织损伤评分。在后续研究中，我们会增加实验动物的数量，再次检测以上指标，验证高、中剂量组的疗效，并进一步探究IL-1Ra对大鼠肠I/R诱导的肠损伤发挥保护作用的具体机制。
总之，肠I/R损伤是临床常见疾病，该损伤不仅会损伤局部肠组织，还可能导致肠黏膜屏障损伤，致使细菌移位、炎性介质释放，诱发急性肺损伤、系统性炎症反应综合征等远端器官或全身的炎症反应[4]，致死率高。因此，针对肠I/R损伤的治疗，是重创伤救治领域密切关注的热点问题。本研究发现，IL-1Ra对肠I/R诱发的的炎症反应和氧化应激反应具有明显的抑制作用，在肠I/R损伤的治疗方面具有巨大的潜力，有望成为治疗这类疾病的新药。
( 致谢: 本实验在军事医学科学院基础医学研究所基因组工程研究室完成，衷心感谢各位老师和同学的帮助与鼓励！)
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