2. 中国人民解放军第一七四医院老年科，福建 厦门 361000;
3. 福州市第一医院老年科，福建 福州 350009;
4. 福建医科大学附属协和医院烧伤研究所，福建 福州 350001;
5. 山东省临沂市人民医院老年科，山东 临沂 276000
2. Dept of Traditional Chinese Medicine, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;
3. Dept of Geriatrics, 174th Hospital of People's Liberation Army, Xiamen Fujian 361000, China;
4. Dept of Geriatrics, First Hospital of Fuzhou, Fuzhou 350009, China;
5. Institute of Burn, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)来源方便，能在体外培养、增殖，可分化为多种细胞，且可分泌多种营养因子和调节免疫等功能，故可成为临床疾病的辅助治疗手段。目前尚未发现BMSCs完全特异性细胞表面分子，实验中所应用的表面分子，只能相对接近，除外造血前体细胞特异的CD34，白细胞特异的CD45，以及检测出BMSCs CD29、CD90、CD44、CD105，即可认为所检测出的细胞为BMSCs。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)定向迁移到受损的组织是其发挥组织修复的重要前提。MSCs的迁移过程包含多个环节，其中趋化因子及其相应受体起重要作用。趋化因子不仅有调节细胞增殖、分化、免疫功能的能力，还有促迁移作用。趋化因子受体CXCR4(chemokine C-X-C motif receptor 4)属于7次跨膜的G蛋白偶联受体[1]。基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)为多见的存在于中枢神经系统的一种趋化因子。组织损伤或炎症时，组织内SDF-1表达逐渐增加，与血液循环中MSCs表达的CXCR4相互作用，促进MSCs的迁移[2]。Wang等[3]在恒久性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型中，注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的BMSCs，免疫组化发现嗅区到大脑皮层途径中都分布着BMSCs，大鼠神经功能也有改善，而BMSCs的迁移可被CXCR4抑制剂AMD3100抑制。
毛冬甲青素(ilexonin A, IA)是从中药毛冬青中加工分离提取的化合物，具有活血化瘀、抗血栓、抗炎症等广泛的药理作用。我们的前期研究表明，大鼠脑缺血/再灌注后，内源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和生长相关蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43)表达增高，皮层亦出现BrdU/NeuN的双标阳性细胞[4]，而IA干预后bFGF和GAP-43明显增高，相应皮层BrdU/NeuN的双标阳性细胞增加[5]。IA促进缺血侧皮层BrdU/NeuN标记阳性细胞生成是否与促进脑缺血后侧脑室下层区域神经干细胞的再生和分化，并向皮层运动迁移有关。本课题拟研究IA对BMSCs增殖及迁移的影响，对BMSCs应用于脑梗死的治疗具有非常重要的意义。由于CXCR4在BMSCs的表达率低，故设想通过IA体外干预BMSCs，并推测其通过提高CXCR4的表达可有利于BMSCs迁移至脑缺血区组织。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SD大鼠8只，♂，体质量60~100 g，清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证批号：SCXK(沪):2012-0002。
1.1.2 药物与试剂注射用毛冬青甲素购自广东省博罗先锋药业(40 g/2 L)，产品批准文号：国药准字Z44023366，批号：090101。MTT、AMD3100购自美国Sigma公司；胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、DMEM/F12、PBS、0.25%胰蛋白酶(0.03% EDTA)，购自美国Gibco公司；小鼠抗大鼠CD90-PE单克隆抗体、小鼠抗大鼠CD45-PE单克隆抗体、小鼠抗大鼠CD29-PE单克隆抗体，购自美国Biolegend公司；小鼠抗大鼠CD34-PE单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；进口羊血清工作液、DAPI、FITC标记山羊抗兔二抗，购自北京中杉金桥公司；兔抗大鼠CXCR4抗体购自美国Abcam公司。
1.1.3 仪器CO2恒温培养箱购自日本三洋公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司；超净工作台购自中国苏净集团；流式细胞仪购自英国Apogee公司；全自动凝胶图像分析仪购自美国Bio-Rad公司；低温离心机购自德国HERMLE公司；全自动酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。
1.2 方法 1.2.1 大鼠BMSCs的培养颈椎脱臼处死大鼠后，保留股骨及胫骨, 去除股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用10%胎牛血清DMEM/F12培养基(添加青、链霉素1 :100稀释)冲洗骨髓，使流出骨髓腔。将骨髓制成单细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶中，保持细胞密度为1×109·L-1，置37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养。培养48 h，更换培养基，以后每2~3 d更换1次。待细胞密度长至80%~90%融合，加入0.25%胰酶消化，以1 :2的比例培养传代。
1.2.2 大鼠BMSCs的鉴定取第3代细胞生长汇合至80%以上，制备单细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入PBS重悬细胞沉淀，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS缓冲液，将单细胞悬液分装至每管约5×105个细胞的5支样品管中。分别加入5 μL PBS(阴性对照)、5μL PE标记抗大鼠CD29、5 μL PE标记抗大鼠CD90、5 μL PE标记抗大鼠CD34、5 μL PE标记抗大鼠CD45抗体，吹打均匀，4℃冰箱内避光孵育30 min；加入3 mL PBS 1 000 r·min-1离心5min，弃上清，每管加入500 μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，待测。
1.2.3 大鼠BMSCs生长曲线的测定将大鼠BMSCs传至2代后，接种于7块96孔培养板，每块接种6孔，接种密度4×103/孔，培养板置CO2培养箱37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。每日1板进行MTT检测。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，37℃孵箱中孵育4 h后，小心吸弃上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min。在酶标仪上492 nm波长测定各孔吸光度值，以A492 nm吸光度值表示细胞增殖水平。以吸光度值为纵轴、时间为横轴，绘制细胞生长曲线。
1.2.4 IA预处理BMSCs最佳剂量及时间筛选第3代BMSCs生长汇合至80%~90%时消化，制成单细胞悬液，细胞浓度调整为5×107·L-1，接种至96孔板，每孔200 μL细胞悬液；1 d后细胞完全贴壁，弃培养基，加入含IA (3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1)的10% FBS培养基或10% FBS DMEM/F12培养基(对照组)，分别孵育24、48、72 h，MTT法检测样品A492吸光度值，期间每隔24 h换新鲜含药培养基。每组设6个复孔。
1.2.5 Transwell检测细胞迁移将第2代BMSCs生长汇合至80%~90%时消化，制备单细胞悬液，按1×108·L-1接种至6孔板内，24 h后更换为含IA(3.125、6.25 mg·L-1)的10% FBS培养基，孵育48 h，PBS洗2遍，胰酶消化，制成细胞浓度为5×108·L-1含2% FBS DMEM/F12培养基的悬液，取200 μL置于Transwell小室中，每组设4个复孔。阻断实验中，消化接种的细胞培养24 h后，更换为含IA(6.25 mg·L-1)的10% FBS DMEM/F12培养基，孵育48 h，PBS洗2遍，再加入CXCR4阻断剂AMD3100(5 mg·L-1)，置于37℃、5% CO2培养箱30 min后，PBS洗2遍，胰酶消化，制成上述相同细胞浓度的悬液，置于Transwell小室中。Transwell下室为500 μL含2% FBS DMEM/F12、0.1 mg·L-1 SDF-1α的培养基，孵箱中静置6 h，PBS洗涤后，4%多聚甲醛室温固定15min，蒸馏水洗涤，0.1%结晶紫染色小室外侧面细胞15 min，蒸馏水洗涤，晾干，于倒置相差显微镜下拍照。将Transwell小室聚碳酸酯穿透膜浸入200 μL结晶紫脱色液中脱色，酶标仪492 nm波长测定各孔吸光度值，以A492吸光度值表示细胞穿透数量。
1.2.6 CXCR4免疫荧光染色将BMSCs接种到放入盖玻片的12孔培养板内，待细胞达到60%~70%融合，PBS冲洗。取载玻片，PBS冲洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗5 min×3次，山羊血清37℃封闭30 min，滴加兔抗大鼠CXCR4多克隆抗体(1 :200)，4℃孵育过夜。PBS (含0.1% Triton X-100)室温下冲洗5 min×3次，滴加FITC标记的山羊抗兔二抗(1 :200)室温避光孵育2 h，PBS冲洗5 min×3次，滴加适量的DAPI避光复染5 min，PBS冲洗5 min×3次。加抗荧光淬灭剂晾干、封片、荧光显微镜观察。PBS代替一抗作阴性对照，染色后胞质、胞核呈绿色的为CXCR4阳性细胞，胞核呈蓝色的为DAPI标记的细胞核。
1.2.7 Western blot检测用蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印至NC膜上；5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h；加入以TBST稀释的兔抗大鼠CXCR4多克隆抗体、小鼠β-actin单克隆抗体(1 :2 000)过夜；TBST洗膜10 min×5次；加入TBST稀释的相应二抗(1 :6000)，室温孵育2 h；TBST洗膜10 min×5次，化学发光法显影，X线片曝光，用Image Master® VDS凝胶成像及分析系统采集胶片上的蛋白条带图像，与相应β-actin蛋白条带密度相比较，计算各条带的灰度值。
1.2.8 统计学方法所有数据均用统计软件SPSS 19处理，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析, 两组间比较采用t检验。实验结果均重复3次。
2 结果 2.1 BMSCs的体外培养原代培养时，把浑浊骨髓液接种入塑料培养瓶并轻微摇匀，镜下观察，绝大多数为圆形细胞并悬浮于培养液，只有少量细胞附壁。48 h换液后，可见部分细胞呈集落样贴壁，多呈梭形或多角形。3~4 d时细胞形态逐渐变细、变长，相互靠近，7~8 d细胞即相互接触，9~10 d细胞排列紧密，融合80%~90%时呈漩涡状(Fig 1)。
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| Fig 1 Culture of BMSCs in vitro(×200, scale bar: 50 μm) A: The first generation of BMSCs gave priority to spindle cells, with more mixed cells of round shape; B: The third generation of BMSCs, the mixed cells were less visible than the first generation cells. |
第3代BMSCs，CD29阳性细胞率为100.0%(Fig 2A)，CD90阳性细胞率为99.5%(Fig 2B)，CD45阳性细胞率为1.0%(Fig 2C)，CD34阳性细胞率为0.8%(Fig 2D)。
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| Fig 2 The surface markers of BMSCs through flow cytometry A: CD29, the positive rate was 100.0%; B: CD90, the positive rate was 99.5%; C: CD45, the positive rate was 1.0%; D: CD34, the positive rate was 0.8%. |
BMSCs在接种d 1~2，为细胞适应新环境时期，细胞增殖不明显。3~6 d镜下可见细胞数量逐渐增多，符合生长曲线的上斜趋势，为细胞快速增长期。7 d后镜下未见细胞间间隙，无多余细胞贴壁空间，增殖明显减慢(Fig 3)。
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| Fig 3 Cell growth curve of BMSCs |
Tab 1结果显示，IA孵育BMSCs 24、48 h，与对照组相比，100~800 mg·L-1剂量组OD值明显降低(P < 0.05)；IA孵育BMSCs 48 h，与对照组相比，IA 3.125、6.25 mg·L-1组OD值明显增加(P < 0.05)；IA孵育BMSCs 72 h，与对照组相比，12.5~800 mg·L-1组OD值明显降低(P < 0.05)，IA 3.125、6.25 mg·L-1组OD值无明显变化。
| Group | Concentration/mg·L-1 | A492nm | ||
| 24 h | 48h | 72h | ||
| Control | - | 0.427±0.022 | 0.458±0.033 | 0.528±0.029 |
| IA | 800 | 0.313±0.019* | 0.306±0.045* | 0.277±0.027* |
| 400 | 0.323±0.028* | 0.320±0.032* | 0.280±0.028* | |
| 200 | 0.341±0.019* | 0.338±0.032* | 0.315±0.034* | |
| 100 | 0.399±0.022* | 0.395±0.030* | 0.390±0.033* | |
| 50 | 0.429±0.024 | 0.435±0.024 | 0.440±0.024* | |
| 25 | 0.434±0.023 | 0.467±0.024 | 0.473±0.025* | |
| 12.5 | 0.448±0.026 | 0.478±0.023 | 0.486±0.025* | |
| 6.25 | 0.441±0.019 | 0.511±0.026* | 0.537±0.033 | |
| 3.125 | 0.444±0.022 | 0.520±0.048* | 0.533±0.042 | |
| *P < 0.05 vs control | ||||
结晶紫染色迁移细胞，如Fig 4所示，与对照组相比，6.25、3.125 mg·L-1 IA明显促进BMSCs的迁移，A492吸光度值明显增加(P < 0.05)。与IA 3.125 mg·L-1组相比，IA 6.25 mg·L-1组迁移细胞数增加，但差异无统计学意义。
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| Fig 4 Effect of IA on BMSCs migration(×200, scale bar: 50 μm) A: Control; B: IA 3.125 mg·L-1; C: IA 6.25 mg·L-1; D: The average optical density of crystal violet staining of BMSCs. *P < 0.05 vs control. |
Fig 5的Transwell结果表明，AMD3100干预组细胞迁移数量与IA (6.25 mg·L-1)组相比明显减少(P < 0.05)。
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| Fig 5 Effect of AMD3100 on migration of BMSCs incubated with IA(×200, scale bar: 50 μm) A: Control; B: IA(6.25 mg·L-1)+AMD3100; C: IA 6.25 mg·L-1; D: The average optical density of crystal violet staining of BMSCs. *P < 0.05 vs IA+AMD3100; #P < 0.05 vs control. |
如Fig 6所示，DAPI使细胞核蓝染，细胞膜及细胞内均可见绿色荧光，提示BMSCs的细胞质及细胞膜均有CXCR4表达。
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| Fig 6 The fluorescence microscopy of CXCR4(×200, scale bar: 50 μm) A:CXCR4;B:DAPI; C:Merged |
如Fig 7所示，与对照组比较，IA(6.25、3.125 mg·L-1)预处理BMSCs 48 h明显上调CXCR4蛋白的表达(P < 0.05)，且与IA 3.125 mg·L-1组比较，IA 6.25 mg·L-1组CXCR4蛋白表达明显升高(P < 0.05)。
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| Fig 7 CXCR4 protein detected by Western blot *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs IA 3.125 mg·L-1group |
间充质干细胞于骨髓组织中的干骺端含量丰富，且提取相对比较方便。本实验充分应用了BMSCs对塑料培养瓶的良好黏附特征，采用换液和及时传代等方式，可以很好去除大部分杂细胞。传至第3代时，可得纯度较高的BMSCs，其形态为较为均一梭形，生长状态好。传代后的BMSCs 4~5 d便可长满，增殖能力强，其生长曲线呈S形，符合多数细胞的生长特性。流式细胞仪可检测到CD29和CD90表达阳性，CD34和CD45表达阴性，表明是纯度相当高的BMSCs，有异于造血细胞。
无论是人来源的或非人来源的MSCs用于移植治疗中风后的鼠科动物，均取得较好的效果，其机制为MSCs迁移定位于大脑中，分化为神经细胞和胶质细胞。这其中有转分化、神经细胞形成、血管形成和激活内源神经干细胞修复[6]。SDF-1/CXCR4轴在趋化循环干细胞定位于受损部位，进而促进干细胞存活及往组织损伤细胞相应分化、诱导损伤区微血管生成中发挥重要作用[7]。Roland等[8]发现，SDF-1α结合受体CXCR4产生趋化的机制是通过激活受体下游的效应元件，导致相关核转录因子和激酶磷酸化，引起肌动蛋白、肌球蛋白等细胞骨架蛋白的含量、成分或分布发生改变，引起细胞变形，继而迁移。正常情况下，机体大多数组织表达低水平SDF-1α，当脑卒中1个月后，可发现缺血边缘区SDF-1α表达上调，并持续到第4个月，原位杂交发现BMSCs优先迁移至缺血区，并于缺血区发现部分标记的BMSCs，表达神经胶质纤维蛋白、微管相关蛋白、星形胶质细胞和神经元标志物，且体内外证实BMSCs表达CXCR4[9]。用慢病毒技术转染BMSCs使其过表达CXCR4，过表达CXCR4的BMSCs在缺血区中的分布明显多于单纯BMSCs移植组，同时选择siRNA技术阻断CXCR4蛋白表达，缺血区eGFP标记的BMSCs明显减少[10]。
本实验发现，IA孵育BMSCs 24、48 h，与对照组相比，100~800 mg·L-1剂量组细胞增殖明显减少(P < 0.05)，100~800 mg·L-1剂量组可能因高药物浓度而不利于BMSCs的增殖；IA孵育BMSCs 48 h，与对照组相比，6.25、3.125 mg·L-1剂量组细胞增殖明显增加(P < 0.05)，促进BMSCs的增殖；IA孵育BMSCs 72 h，与对照组相比，12.5~800 mg·L-1剂量细胞增殖明显减少(P < 0.05)。综上可知，100~800 mg·L-1药物浓度组24 h前就开始抑制细胞增殖，在48 h后依然可见其抑制作用，而IA 6.25、3.125 mg·L-1在24 h未见促进BMSCs增殖，直到48 h才可见其促进作用。72 h未见各浓度有促进增殖作用，提示IA 12.5~800 mg·L-1组预处理时间过长都可能影响BMSCs的细胞周期，对细胞有毒性作用，从而干预BMSCs增殖。而IA 6.25、3.125 mg·L-1在72 h与对照组相比，无明显促进细胞增殖作用，考虑时间因素和对照组在48~72 h细胞增殖幅度快于6.25、3.125 mg·L-1剂量组。故后续实验IA预处理的剂量为6.25、3.125 mg·L-1，时间在48 h较为合理。
Transwell小室的上层小室内BMSCs的趋化动力来源于下层含0.1 mg·L-1的重组大鼠源SDF-1α。在下层趋化因子SDF-1α的诱导下，体外BMSCs的迁移能力同样很强，并且IA 3.125、6.25 mg·L-1预处理能够激活BMSCs的迁移潜能。与对照组比较，IA 3.125、6.25 mg·L-1预处理48 h均明显促进BMSCs迁移，两剂量组间差异没有显著性。与IA最佳剂量组(6.25 mg·L-1)相比，使用CXCR4特异性抑制剂AMD3100能明显降低细胞迁移数量，提示AMD3100可阻断IA对BMSCs迁移的促进作用。镜下AMD3100干预组可见有部分细胞迁移，提示细胞可能通过其他表面受体如CXCR7起作用，SDF-1α也能够与该受体作用，而该受体可能与CXCR4协同，调节CXCR4激活下游信号通路而起作用[11-12]。
Western blot结果表明，与对照组比较，IA 6.25、3.125 mg·L-1组干预BMSCs 48 h均可见CXCR4蛋白表达增多，与IA 3.125 mg·L-1组相比，IA 6.25 mg·L-1组CXCR4蛋白表达明显升高。但上述Transwell实验中，两个剂量组间却没有明显差异。免疫荧光染色结果表明，CXCR4于细胞内、细胞膜都表达，与已报道的结果一致[13]，而IA 6.25 mg·L-1组可能主要是增加CXCR4总蛋白(膜蛋白与细胞内蛋白之和)的表达远大于膜蛋白的表达增加。由此表明，IA预处理BMSCs能够促进CXCR4蛋白表达水平的提高，有利于BMSCs更多、更快进入组织损伤区[14]，证实CXCR4在趋化BMSCs迁移中可能起关键作用。用合适剂量的IA干预移植前BMSCs，可能促进BMSCs向损伤的中枢脑组织定向迁移，并可能取得良好疗效[15]。
( 致谢: 本实验在福建医科大学附属协和医院烧伤研究所完成，在此对实验室老师的指导和帮助表示衷心的感谢！)
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