p53蛋白是一个重要的转录因子，通过调节p21、Bax、PTEN、p48、PAI等下游靶基因，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡与衰老、参与DNA损伤修复以及抑制血管生成(Fig 1)，阻止肿瘤的发生与发展。突变p53则会缺失正常功能，获得促癌性作用，增强肿瘤的迁移运动和侵袭转移，加速肿瘤细胞出现耐药性，说明突变p53是促癌的一个重要因素，所以p53蛋白可以成为一个治疗肿瘤的药物靶点之一。目前，主要的治疗策略有阻断p53与MDM2相互作用、降解突变p53蛋白、抑制突变p53下游通路、RNA干扰突变p53表达、恢复突变p53构象等[1]。由于p53蛋白空间结构的柔韧性和灵活性，以p53为靶点恢复构象已成为一个研究热点[2]，本文将重点阐述恢复突变p53的药物研究进展及其在肿瘤治疗中的作用机制。
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| Fig 1 p53 signaling pathway |
p53蛋白单体由393个氨基酸残基组成，利用化学交联和质谱技术发现全长p53蛋白四级结构是1个细长的十字形结构，CD区与DNA结合，TAD区、CTD区以及Tet区向四周伸展[3]。p53蛋白核心区域多发生突变，失去DNA结合能力，研究发现四股β片层和五股β片层反平行相间形成的三明治结构支撑着p53核心区域，2个大的环结构(L2/L3)和1个环-片-螺旋结构域(loop-sheet-helix motif，LSH)在β片层骨架结构上共形成DNA结合面，p53蛋白结合靶基因的位置。人类肿瘤中发现突变p53位点多发生在此结合面上，破坏DNA结合的完整结构，改变与DNA的结合能力，失去正常生理功能。
鉴于p53蛋白突变主要发生在DNA核心区域，根据对DNA结合域(DNA binding domain，DBD)结构改变的影响，p53突变可分为3类。Ⅰ类突变是改变DNA接触面上氨基酸残基(Arg273、Arg248)，失去与DNA结合能力的DNA接触突变，如R273H、R248Q。R273位点位于LSH二级结构域上，R248位点位于Loop L3上，与DNA磷酸骨架结合，精氨酸残基的胍基与邻近的氨基酸羰基通过疏水键、盐桥接合，稳定DNA结合结构[4]。第273位和第248位精氨酸发生突变后，盐桥和疏水作用减弱，对DNA的亲和力降低甚至丧失。Ⅱ类突变是改变β片层骨架与DNA接触面连接的氨基酸残基(Arg175、Arg249)，影响DNA接触面正确定向的突变，如R175H、R249S。R175位点位于Loop L2结构，与锌离子位点邻近，它是连接Loop L2和Loop L3相互作用形成DNA核心区域构象的桥梁，R175的胍基提供疏水力，与Loop L2上的Met237和Loop L3上Ser183、Pro191的羰基相互作用，R175位点突变后，疏水作用消失，Loop L2和Loop L3不再作用，导致p53蛋白核心结构松散，失去功能。R249位点突变也是因为精氨酸突变，疏水力缺失，不能稳定Loop L3结构，DNA结合面改变，影响DBD作用。Ⅲ类突变发生在β片层骨架结构内，改变整个DBD区三级结构，如V143A、Y220C，V143A突变位于β股S3二级结构，Y220C突变位于S7-S8环结构，这两种突变体在37℃下没有蛋白活性，而在30℃和24℃下可以保持野生型或接近野生型的p53构象，激活p53下游靶基因如p21，有温度敏感性[5]。
2 突变p53作为肿瘤药物靶点在抑癌基因中，p53是研究最多的基因之一，其突变多为错义突变，发生在DNA结合区，突变p53蛋白在许多肿瘤细胞中稳定表达，且失去对PUMA、Bcl-2等基因转录激活作用，抑制癌细胞凋亡。Ventura1等[6]在小鼠体内恢复p53活性发现可以抑制肿瘤的生长，证实了重激活p53抗癌治疗的潜力。
人类活性p53蛋白以四聚体的形式存在，通过核心区与四聚体区之间的柔韧连接区将DNA螺旋包裹结合，p53突变后热力学和动力学稳定性下降，蛋白结构不稳定，活性构象改变，失去转录激活能力，但其不会失活，仍保持着构象从非折叠向折叠转换的能力[7]。一般来说，p53蛋白突变多为点突变，所以构象稳定性的改变是微小的，小分子化合物才可以恢复DNA结合表面的结构域。这种突变构象改变的微弱性以及自身结构的可恢复性，为设计小分子化合物恢复p53构象提供了可能性。
3 靶向突变p53药物研究PhiKan083是第一个根据Y220C突变型设计出来的咔唑类化合物(Fig 2A)，Tyr220位于β片层与Loop S7/S8连接部位，Y220的侧链可以部分填补p53蛋白表面的结合裂缝，保持蛋白结构稳定，但Y220C突变打开了此结合裂缝，降低了结合表面蛋白的稳定性，改变了其构象失去活性[8]。半胱氨酸打开的这个裂缝成为了亲水性化合物结合位点，PhiKan083的咔唑环可以挤进裂缝，烷基占据裂缝底部，由于表面的结合裂缝是疏水性的，PhiKan083的甲酰胺基团恰好与Asp228主链的羰基疏水键相互作用，重新稳定裂缝，转变突变p53蛋白表面构象，进而恢复了活性。之后发现的PK7088(Fig 2B)和PhiKan083一样具有一个吡唑环结构，不过PK7088与Y220C的体外解离常数为140 μmol·L-1，小于PhiKan083与Y220C的解离常数，所以PK7088可以更好地结合并稳定Y220C突变体[9]。Bauer等[10]合成了含氟的PhiKan083衍生物，即在N-乙烷基上加氟原子，氟原子不仅可以和Leu145、Trp146的羰基相互作用，还可以与Cys220的巯基氢键结合，使氟原子倾向于结合裂缝的底部，产生的这种拉力使氟化的PhiKan083衍生物比PhiKan083对p53Y220C突变体的亲和力提高了5倍，让咔唑环更稳定地挤入裂缝。Wilcken等[11]筛选到二碘代酚系列化合物(Fig 2C)，它的亲水性苯环骨架位于Y220C的裂缝中央，其中一个碘原子接近Cys220的硫原子，另一个碘原子与Leu145主链上氧原子共价结合，酚羟基疏水作用于Val147、Asp228，碘原子和酚羟基的共作用使得二碘代酚化合物更稳定有力地结合Y220C突变体。利用计算机分子动态(MD)模拟发现，羟基二苯甲酮类化合物上的羰基氧原子可以与Y220C突变体的Thr150、Thr230、Pro151、Cys220、Cys229氨基氢之间形成氢键(Fig 2D)，与Y220C结构对接恢复其突变构象。羟基二苯甲酮类化合物与PhiKan083一样可以作为配体靶向p53突变位点，恢复突变结构，进而重激活转录功能。
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| Fig 2 Structures of compounds targeted mutant p53 A: Phikan083; B: Phikan073; C: 2-hydroxy-3, 5-benzaldehyde iodide derivative; D: 1-hydroxy-2-methylanthraquinone derivative; E: PRIMA-1; F: PRIMA-1Met; G: MIRA-1; H: STIMA-1; I: WR1065; J: Stictic acid; K: ZMC1. |
最近报道的PRIMA-1Met(ARP-246)在血液恶性肿瘤和前列腺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验效果良好，在卵巢癌患者中也进行到了Ⅰb/Ⅱ期临床试验[12]。酮类化合物PRIMA-1和PRIMA-1Met(APR-246)可以恢复R175H和R248Q突变体，诱导肿瘤细胞发生凋亡(Fig 2E、2F)，作用机制是这两种化合物的分解底物亚甲基奎宁酮(methylene quinuclidinone，MQ)作为烷基配体，共价修饰突变p53核心区域上多个半胱氨酸的巯基，阻止二硫键相互作用引起的p53聚集。MQ也可以与半胱氨酸残基通过氢键疏水键共价结合形成新的DNA接触位点，突变p53直接获得BDB区的结合能力[13]。p53核心区域有10个半胱氨酸残基，MQ具体与哪个位点的半胱氨酸结合目前并不清楚，不过Cys182、Cys229、Cys242和Cys277这4种氨基酸暴露在核心表面，猜测MQ可能与它们结合。p53核心区域有个L1/S3口袋结构，p53二级结构突变多集中在此区域，Cys124、Cys135、Cys141位于L1/S3中心位置。MQ作为烷基化配体与突变p53R273H的Ser116、Gly117直接反应对接L1/S3结构，恢复p53活性[14]。顺丁烯二酰亚胺类似物MIRA(Fig 2G)、喹啉唑衍生物STIMA-1(Fig 2H)和氨磷汀活性代谢物WR1065(Fig 2I)同样作为烷基化配体，与半胱氨酸残基的巯基和赖氨酸残基的氨基反应，恢复R175、R273、G248、V272位点突变。早期研究发现，大部分p53突变体中L1/S3口袋结构是打开的，Cys124突变成Ala124后，在空间上部分阻塞这个开口结构，阻止小分子化合物与L1/S3结构对接，失去对半胱氨酸残基烷基化功能，抑制恢复p53活性，如C124A解除PRIMA-1对p53R175H重激活作用[15]。芳香族有机化合物Stictic acid(Fig 2J)直接与GLn144发生烷基化反应，间接与GLy112、Ser116、Cys124相互作用，这种与氨基酸的多作用力增强了Stictic acid分子与L1/S3结构的对接能力，此外，Stictic acid分子结构比MQ大，使L1/S3结构被迫打开，所以不会被C124A突变抑制功能[15]。
p53蛋白的Arg175侧链胍基可以与Pro191、Met237、Asp184利用疏水力、盐桥相互作用，这种分子布局与锌离子配体中的Cys176、His179、Cys238相邻，精氨酸突变成组氨酸后，失去作用力，降低与锌离子的亲和力，甚至失去锌离子配体，锌离子的缺失会进一步导致p53蛋白热力稳定性下降，增加聚集倾向，此时的p53成为脱辅基蛋白失去功能。前期研究发现[16]，MMTV-neu转基因小鼠的乳腺癌肿瘤对阿霉素有耐药性，锌离子联合使用会抑制小鼠体内乳腺癌肿瘤的生长。在SK-BR-3(p53R175H)乳腺癌细胞和U373MG(p53R273H)人胶质瘤细胞中，锌离子会诱导突变型p53R175H/R273H部分转变成有功能活性的野生型p53[17]。锌离子的这种特殊作用引起了研究学者的兴趣，随后筛选得到的缩氧硫脲类化合物NSC319726作为锌离子螯合剂(ZMC1)，运送锌离子到p53R175H蛋白(Fig 2K)，恢复p53R175H蛋白缺失锌离子状态，重获蛋白活性。缩氧脲类化合物螯合铁离子产生羟基自由基会攻击p53蛋白上半胱氨酸的巯基发生氧化还原反应，影响p53蛋白构象折叠[18]。Blanden等[19]合成了1个ZMC1，螯合锌离子能力比NSC319726强，调控细胞内锌离子浓度，能够为恢复p53R175H构象提供最适锌离子浓度范围。Garufi等[20]利用pAb1620和pAb240抗体免疫荧光实验，发现锌离子姜黄素复合物依赖于锌离子恢复p53R175H、R273H蛋白构象，不过具体分子机制有待进一步研究。最近，Aggarual等[21]在十字花科蔬菜中提取出的苯乙基异硫氰酯(PEITC)，可以抑制SK-BR-3(p53R175H)细胞生长，诱导其凋亡。研究发现，ZnCl2可以提高PEITC活性，猜测PEITC可能作为一种锌离子伴侣，恢复p53R175H的构象，其中小分子作用机制有待进一步证明。
目前发现，除了小分子化合物类可以恢复突变p53构象，还有多肽类分子，如多肽46，第1个来自p53-C端区域的人工合成肽(361-382)，可以替代突变p53的CTD区，与核心区带电氨基酸结合，改变蛋白构象，恢复R175H和R273H突变体DNA结合功能[22]。另一个多肽小分子CDB3，根据p53结合蛋白53BP2区域(490-498)设计出来的9个多肽物，与核心区上多个位置结合，集中在Loop3和Helix2之间。实验发现，FL-CDB3可以和G245S、R249S结构突变体结合，恢复构象折叠，提高β片层突变I195T与DNA结合的Kd值，恢复p53(R175H、R237H)转录激活功能。CDB3自身与突变p53结合后，p53蛋白会被激活，重新结合的靶基因会占据CDB3位置，进而被释放回细胞，继续靶向其他突变p53[23]。最近发现的两亲性穿透肽p28，一段来自天青蛋白的28个氨基酸序列多肽，可以进入癌细胞，与p53蛋白的DNA结合域结合，恢复突变体活性。p28主要结合位点在非突变Loop L1(氨基酸112-124)和突变Loop L7/L8区域(Y220C、P223L)。两性亲和特性使p28可以改变Loop L1、Loop L7/L8二级结构上疏水氨基酸残疾的疏水性，如Leu114、Cys124，只是调整p53 DBD二级结构，不会改变p53整体构象[24]。多肽小分子虽然可以进入细胞发挥恢复p53功能作用，不过较小分子化合物来说，后期研究进入人类体内很难保持稳定性，发挥作用。
4 总结与展望目前以突变p53为靶点恢复构象的主要有多肽类和小分子化合物，但是大部分小分子化合物是利用细胞和蛋白实验筛选得到，生物学效应研究的较为清楚，对于它们中的大多数，分子化学作用机制仍没有完全理解，这将会成为以后重点研究方向。近几年来，基于蛋白质和细胞筛选体系，虽已有许多p53活化物被发现，但其中大部分不直接和p53蛋白结合，而是抑制p53与MDM2的相互作用，如Nutlin-3[25]，或是抑制突变p53分子伴侣进而降解突变p53，如17AAG、SAHA。目前，直接针对p53蛋白结构的药物设计处于初级阶段，p53蛋白突变并不会导致蛋白失去活性，其仍具有热力动力学不稳定的特性，所以小分子化合物可以直接对接p53蛋白，恢复活性构象。了解突变p53蛋白结构是恢复其活性的前提，目前面临最大的挑战是精准地探索出不同p53突变体的结构特征，与此同时，由于个体的差异性，发展先进的诊断方法，确定不同癌症患者突变p53的类型，实现癌症的精准治疗也是必不可少的。
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