2. 中山大学药学院临床药理研究所,广东 广州 510006
2. Institute of Clinical Pharmacology, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China
肝纤维化是肝硬化演变发展过程中的一个重要阶段,是继发于各种慢性致病因素引起的肝脏损伤和炎症后组织修复过程的代偿反应,其严重程度是肝硬化、肝细胞癌等远期预后的重要危险因素,其发展过程受多种细胞因子和信号路通的调控。随着科学技术的发展,目前已有大量的新技术和新方法被应用于肝纤维化的研究领域,并发现了许多新的治疗肝纤维化的信号通路,如TGF-β1/Smad、ERK、Nrf2-ARE等[1-2]。然而,肝纤维化的发病机制是一个极为复杂的信号交织网,目前临床上尚无十分有效的抗肝纤维化药物。因此,需要不断探索新的发病机制,寻找新的治疗靶标,为今后肝纤维化的分子靶向治疗提供依据。近年来,有实验研究表明,DJ-1蛋白在肝纤维化的发生、发展过程中发挥着重要的作用,被认为是治疗肝纤维化的潜在靶点[3-4]。DJ-1蛋白下调可使肝细胞、肝Kupffer细胞氧自由基水平降低,炎症细胞和吞噬细胞浸润减少等,延缓肝纤维化的进程。本文总结了以DJ-1蛋白为靶点治疗肝纤维化的最新进展,详细论述了DJ-1在治疗肝纤维化中的作用。
1 肝纤维化与氧化应激的关系肝纤维化的形成是一个相当复杂的病理过程,它包括了肝细胞的凋亡、间充质细胞的增殖、细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的沉积等过程。细胞外基质的沉积破坏了肝脏的正常组织学结构,最终导致了肝硬化的发生。其病理中心环节是肝星状细胞由静止状态转变为活化状态[5]。许多因素如炎症因子、细胞外基质的改变、生长因子以及氧化应激等都可以刺激肝星状细胞使其活化,尤其是氧化应激在肝纤维化过程中起着重要的作用[6]。氧自由基介导肝纤维化发生,首先是肝组织内氧自由基产生增多而清除减少,引起肝细胞、肝Kupffer细胞、嗜中性粒细胞等炎症细胞的过氧化损伤,产生的氧自由基及其他分泌物进一步促进肝星状细胞活化。高水平的氧自由基还可以通过激活炎症信号通路,如MAPK、NF-κB、JAK-STAT等,加剧细胞内炎症反应[7-8]。因此,氧自由基可以通过直接激活肝星状细胞来促进肝纤维化发生,胶原蛋白沉积增加和炎症反应加剧又进一步促使肝纤维化进展。
2 DJ-1系统概述 2.1 DJ-1蛋白结构DJ-1基因(RS/PARK7/CAP1)位于人1号染色体短臂的远端(1p36.12-1p36.33),其mRNA含有567个编码子,编码189个氨基酸残基、分子质量约20 ku的保守蛋白[9]。DJ-1蛋白于1997年首次由Nagakubo等[10]报道,当时DJ-1被认为是能够协同Ras蛋白引起小鼠NIH-3T3细胞转化的一种新的丝裂原依赖型癌基因蛋白。随后研究发现,DJ-1蛋白隶属Thi/PfpI超家族,在进化上高度保守,其晶体结构[11]呈黄素氧化还原蛋白样的罗斯曼折叠,是α/β三明治式的折叠结构,核心为7股平行的β-折叠。DJ-1是一个胞内蛋白,主要以同源二聚体的形式存在于胞质[11],此外,细胞核与线粒体等部位也少量分布。DJ-1蛋白通过C末端2个螺旋结构和N末端1个螺旋结构共同形成疏水区域,进而相互连接成同源二聚体,发挥其生理功能。DJ-1的L166P致病突变体是由于疏水区域的166位的亮氨酸突变为脯氨酸,阻止了C末端的正常折叠,导致不能形成同源二聚体,此为其致病的结构基础。突变导致DJ-1蛋白无法正确折叠形成正确的二聚体而易于被泛素-蛋白酶系统降解,并因此失去抗氧化应激作用。另外,L166P还严重影响了DJ-1第106位半胱氨酸的区域,该区域是形成二聚体的关键区域,也可通过氧化自身来抵抗氧化应激。
2.2 DJ-1蛋白功能DJ-1蛋白广泛表达于机体各组织器官,并在肝脏、大脑、肾脏、心脏、眼、睾丸、前列腺等部位呈现高表达[12]。过去10多年报道了大量关于DJ-1与帕金森病和癌症相关性的研究,DJ-1蛋白参与了多种生物学途径,包括抗氧化应激[13]、转录调控[14]、线粒体调控[15-16]、癌症诱导[9]、雄激素受体信号通路、精子形成和受精[17]等(DJ-1蛋白组织分布、功能及相关疾病总结见Tab 1),尤其是在控制活性氧自由基水平以及降低氧化应激引起的细胞凋亡方面起着重要的作用。正常情况下,DJ-1主要位于细胞质和膜间隙中,只有很少存在于细胞核与线粒体中;氧化应激刺激下,DJ-1向线粒体转位,若继续刺激则移向细胞核,发挥抗氧化作用[18]。正是由于DJ-1与氧化应激、肝纤维化与氧化应激之间密切的相关性,引起了研究者们对DJ-1与肝纤维化相关性的研究兴趣。
Distribution | Function | Related diseases |
Liver | The anti-oxidative stress of DJ-1 protein is closely related to liver disease. | Liver fibrosis, liver cancer |
Brain | The DJ-1 protein protects neuronal cells through anti-oxidative stress and anti-apoptosis. | Parkinson's syndrome, Al-zheimer's disease |
Kidney | DJ-1 protein inhibits the expression of anti-fibrosis factor PTEN and promotes tubulointerstitial fibrosis. | Tubulointerstitial fibrosis |
Heart | Protect the vascular endothelial cells and cardiomyocytes, maintain hemodynamic stability. | Heart failure |
Eye | Protect retinal pigment epithelial cells. | Senile macular degeneration, corneal endothelium malnutrition |
Testis | Deficiency of DJ-1 affects sperm production and vitality | Infertility |
DJ-1在清除活性氧自由基的过程中发挥着重要作用。有研究指出,在体外诱导的DJ-1缺乏的多巴胺神经元对H2O2诱导的氧化应激反应更加敏感,最终导致细胞凋亡[19]。因此,DJ-1可以通过抗氧化应激反应来保护细胞免受损伤。除此之外,在DJ-1敲除的SH-SY5Y细胞系和小鼠模型中,DJ-1还能通过ERK1/2通路,下调超氧化物歧化酶1(SOD1)基因表达来清除氧自由基[20]。这些研究都表明DJ-1能参与细胞内氧自由基的防御反应,与DJ-1发挥抗氧化作用相关的分子物质见Fig 1,这些物质都有可能成为未来防治疾病的重要靶标[11]。
近年来有研究证实,在四氯化碳诱导的肝纤维化模型和肝硬化患者的肝组织中,DJ-1呈过表达状态,与野生型小鼠肝脏模型相比,DJ-1敲除的小鼠肝脏模型中氧自由基水平明显降低。这一结果表明DJ-1敲除的小鼠肝细胞内氧自由基水平降低,说明肝脏组织中DJ-1水平的升高是肝纤维化的危险因素之一[3]。这一结果正好与之前人们认为的DJ-1能发挥抗氧化作用相反,DJ-1也可能促使氧自由基的产生。Vasseur等[21]及Liu等[22]的研究也表明,DJ-1敲除的MEF细胞能使细胞内氧自由基蓄积减少,DJ-1在巨噬细胞中以NADPH氧化酶依赖的方式参与氧自由基生产。因此,DJ-1可能在细胞氧自由基水平方面扮演着双重角色,即DJ-1既可作为高氧自由基水平的清道夫,也可在氧自由基水平较低时帮助产生氧自由基。总之,在肝纤维化模型中,与传统的DJ-1上调能起到抗氧化作用不同的是,DJ-1敲除能减轻肝细胞内氧自由基水平,从而延缓肝纤维化的进展。
3.2 DJ-1对肝星状细胞和肝Kupffer细胞的影响在肝纤维化发生发展过程中,活化的肝星状细胞是细胞外基质产生的主要来源。研究发现,与野生型小鼠肝脏模型相比,DJ-1敲除的小鼠肝脏模型中活化的肝星状细胞稍有减少,于是提出了DJ-1可能对肝星状细胞的激活有影响这一假想。但进一步的研究证实,野生型小鼠肝脏模型和DJ-1敲除的小鼠肝脏模型中肝星状细胞活化的标志物例如TIMP-1、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白都有增加,但两种基因型的小鼠之间的差异没有统计学意义[3]。说明DJ-1对肝星状细胞的激活并没有直接的影响。肝纤维化模型中氧自由基主要由肝实质细胞、肝Kupffer细胞和肝星状细胞产生。例如CYP2E1介导肝实质细胞氧自由基产生并诱导增殖、分化及肝星状细胞中胶原蛋白合成,从而加剧肝纤维化[23]。通过实验比较肝Kupffer细胞和肝实质细胞在肝纤维化中氧自由基水平发现,肝Kupffer细胞产生了大量的氧自由基,并且与野生型小鼠肝Kupffer细胞相比,DJ-1敲除的小鼠肝Kupffer细胞氧自由基水平明显降低[3]。由于肝Kupffer细胞属于肝内巨噬细胞,说明DJ-1缺损也可以抑制肝内巨噬细胞氧自由基的产生。由此可知,在肝纤维化模型中,虽然肝星状细胞激活是肝纤维化的中心环节,但是DJ-1敲除发挥抗纤维化作用并不是因为直接抑制肝星状细胞激活,对肝Kupffer细胞氧自由基的清除可能起到了更大的作用。
3.3 DJ-1敲除能抑制肝内炎症细胞浸润Yu等[3]的研究还指出,在急性和慢性肝纤维化模型中,DJ-1敲除的小鼠较野生型小鼠能明显抑制肝脏中中性粒细胞和吞噬细胞的浸润。但是野生型小鼠肝脏中中性粒细胞的增多似乎与传统的趋化因子改变没有明显关联。因为除了单核细胞趋化蛋白-1和趋化因子配体-5这两种和中性粒细胞浸润没有关联的趋化因子外,其他和中性粒细胞浸润密切相关的趋化因子和细胞间黏附分子在两组肝纤维化模型中没有明显差异。但是令人感到好奇的是,由活化巨噬细胞产生的促炎症细胞因子TNF-α和IL-6在DJ-1敲除的小鼠模型中是减少的。因此,在急性和慢性肝纤维化模型中,DJ-1敲除的小鼠肝脏中中性粒细胞和吞噬细胞的浸润减少很可能与肝脏中促炎症细胞因子的减少有关。考虑到某些脂质过氧化产物可以作为中性粒细胞的强效趋化因子[24],中性粒细胞的浸润增加很可能由于野生型小鼠脂质过氧化水平升高引起。
4 总结与展望综上所述,DJ-1蛋白下调可使肝细胞、肝Kupffer细胞氧自由基水平降低,中性粒细胞和吞噬细胞浸润减少等,延缓肝纤维化的进程。然而,DJ-1蛋白对于肝星状细胞的活化并没有直接的影响。在小鼠模型中,DJ-1虽然已被证实在延缓肝纤维化的发生、发展中具有重要作用,但人们对于其具体而深入的作用机制的了解还需要相当长的时间。目前,DJ-1用于治疗肝纤维化作用机制的研究仅仅停留在细胞水平,但是DJ-1蛋白下调是否通过调控某种信号通路发挥抗肝纤维化作用,有待进一步研究。如DJ-1对Nrf2-ARE、PTEN、MAPK、NF-κB、JAK-STAT等信号通路的调节,与还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶1(SOD1)之间的关系是否与肝纤维化有关。更重要的是,我们需要寻找到使DJ-1蛋白下调的拮抗剂,才能使DJ-1蛋白成为治疗肝纤维化更有价值的靶点。总之,DJ-1蛋白为肝纤维化的治疗带来了新的希望。
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