2. 新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药重点实验室, 新疆 乌鲁木齐 830004;
3. 新疆医科大学护理学院, 新疆 乌鲁木齐 830011
2. Xinjiang Key Lab for Uighur Medicines, Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi 830004, China;
3. Nursing College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
目前, 临床上常用的抗炎药物主要为非甾体抗炎药, 其疗效明显, 但均存在潜在的副作用[1]。因此, 寻找低毒高效的新型抗炎药是药物研究的一个重要课题。新疆圆柏(Juniperus Sabina)为柏科圆柏属植物常绿匍匐灌木, 广泛分布于新疆、甘肃和陕北的干旱荒山和沙地之中。据《维吾尔药志》记载, 新疆圆柏枝叶和果实常用于类风湿关节炎等疾病的治疗[2]。花生四烯酸(arachidonic acid, AA)代谢途径和细胞因子网络是抗炎作用的重要靶点, 也是类风湿关节炎治疗药物研发的关键所在。本实验采用环氧合酶1/2(cyclooxygenase-1/2, COX-1/2)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LO)抑制剂筛选试剂盒, 对新疆圆柏枝叶中分离出的总黄酮、槲皮苷、异槲皮苷3种成分进行抗炎活性的初步筛选, 同时采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞体外炎症细胞模型, 观察新疆圆柏有效成分对促炎因子TNF-α的影响。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂新疆圆柏总黄酮、槲皮苷、异槲皮苷由新疆药物研究所赵军研究员建立高速逆流色谱分离纯化并鉴定, 实验时用二甲基亚砜(DMSO)助溶, 加DMEM培养基配制成所需浓度(DMSO浓度不超过5‰); 吲哚美辛(批号G160404, 山西云鹏制药); 胎牛血清(美国Gibco); DMEM培养基(以色列BI); 脂多糖(美国Sigma); TNF-α ELISA试剂盒(美国USCN); COX(Item No.701050)、Lipoxygenase(Item No.760700)试剂盒均购自美国Cayman。
1.2 COX-1/2、5-LO酶体外抗炎活性筛选COX-1筛选实验中设空白组(BC)、对照组(NC)、总黄酮(Fla 12.5、25、50、100 mg·L-1)、异槲皮苷(IQ 25、50、100、200 mg·L-1)和槲皮苷(Q 25、50、100、200 mg·L-1)共14组; COX-2筛选实验中设空白组、对照组、总黄酮(12.5~200 mg·L-1)、异槲皮苷(6.25~100 mg·L-1)和槲皮苷(6.25~100 mg·L-1)共17组; 5-LO筛选实验中设空白组、对照组、总黄酮、异槲皮苷和槲皮苷(12.5~200 mg·L-1)共17组。所有操作严格按说明书进行, 最后计算抑制率及IC50。抑制率=[(OD对照组-OD处理组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%。
1.3 MTT法检测总黄酮、槲皮苷对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用设空白组、对照组、总黄酮和槲皮苷(12.5~200 mg·L-1)共12组, 每组5复孔。调整细胞密度为1×109·L-1, 每孔加入100 μL细胞混悬液, 于37℃、5% CO2条件下培养24 h后, 小心吸弃培养基, 除空白组、对照组外, 每孔分别加入含有不同浓度的药物培养基。分别于24、48、72 h时加入20 μL MTT(5 g·L-1), 继续培养4 h。倾去培养液, 每孔加入150 μL DMSO溶解, 在490 nm处测吸光度, 重复3次。计算细胞抑制率。
1.4 MTT法检测总黄酮、槲皮苷对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的毒性作用设空白组、对照组、LPS组、LPS+不同浓度(12.5~200 mg·L-1)药物组, 共13组, 每组5复孔。细胞培养24 h后, 小心吸弃培养基, 除空白组、对照组、LPS组添加原培养基外, 其余各组每孔分别加入含有不同终浓度的药物培养基, 预处理2 h后, 除空白组、对照组外, 其余各组均加入终浓度为1 mg·L-1的LPS。分别于24、48 h时处理, 方法同上。
1.5 总黄酮、槲皮苷对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响实验分组在细胞毒性分组的基础上, 增加LPS+吲哚美辛(10 mg·L-1)阳性对照组(PC), 共14组, 每组2个复孔。采用ELISA双抗夹心法检测上清液中TNF-α水平。
1.6 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析, 数据用x±s表示, 采用单因素方差分析, 组间比较采用LSD法。
2 结果 2.1 COX-1/2、5-LO酶活性筛选对COX-1/2的抑制作用大小依次为总黄酮、异槲皮苷、槲皮苷; 对5-LO的抑制作用大小依次为槲皮苷、总黄酮、异槲皮苷。
2.2 总黄酮、槲皮苷对RAW264.7细胞及对LPS诱导的RAW264.7细胞的毒性作用总黄酮和槲皮苷对RAW264.7细胞或是诱导后细胞的半数毒性浓度(TC50)均超过200 mg·L-1。
2.3 总黄酮、槲皮苷对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响Tab 1结果显示, 1 mg·L-1 LPS诱导RAW264.7细胞, TNF-α的分泌水平明显高于正常细胞组(P < 0.01), 表明已成功构建RAW264.7细胞炎症反应模型。总黄酮、槲皮苷干预24、48 h, LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α受到不同程度抑制, 量效关系明显(P < 0.01)。在相同刺激条件下, 培养24、48 h时, 总黄酮(50 ~ 200 mg·L-1)、槲皮苷(50 ~ 200 mg·L-1)抑制TNF-α分泌的效果优于阳性对照吲哚美辛(10 mg·L-1)(P < 0.01, P < 0.05), 槲皮苷(25 ~ 200 mg·L-1)抑制TNF-α分泌效果优于总黄酮。
| Group | Concentration/mg·L-1 | 24h TNF-α/mg·L-1 | 48h TNF-α/mg·L-1 |
| NC | - | 27.24±2.33 | 30.38±3.47 |
| LPS | 1 | 513.92±6.48** | 561.92±11.64** |
| PC+LPS | 10 | 303.57±12.42▲▲ | 345.01±4.95▲▲ |
| Fla+LPS | 12.5 | 355.45±5.92▲▲ | 374.46±17.23▲▲ |
| 25 | 316.36±15.51▲▲ | 344.56±9.45▲▲ | |
| 50 | 241.04±7.22▲▲△△ | 308.23±8.36▲▲△△ | |
| 100 | 213.09±20.57▲▲△△ | 231.77±13.97▲▲△△ | |
| 200 | 107.28±10.37▲▲△△ | 158.89±15.20▲▲△△ | |
| Q+LPS | 12.5 | 337.84±14.96▲▲ | 349.98±6.77▲▲ |
| 25 | 287.23±11.64▲▲# | 318.09±3.49▲▲△# | |
| 50 | 225.93±15.03▲▲△△# | 272.38±8.64▲▲△△# | |
| 100 | 174.97±13.29▲▲△△# | 203.02±19.53▲▲△△# | |
| 200 | 85.40±14.41▲▲△△# | 137.12±9.88▲▲△△# | |
| **P < 0.01 vs NC; ▲▲P < 0.01 vs LPS; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs PC+LPS; #P < 0.05 vs Fla+LPS | |||
研究表明, COX-1为组成型酶, 维持正常生理功能, 若抑制COX-1, 则可能导致胃黏膜等的损害[3]。因此, 本实验有选择性地筛选对COX-1抑制作用弱, 对COX-2/5-LO抑制作用强的双重抑制剂。实验结果显示, 槲皮苷对COX-1抑制作用最弱; 在COX-2代谢途径中, 总黄酮表现出对COX-2的强抑制活性, 这可能与异槲皮苷和槲皮苷在该途经中起到协同作用有关, 而异槲皮苷对COX-2的抑制活性较槲皮苷明显, 有可能与两者结构, 尤其是糖苷与其对应的糖苷配基的不同有关[4]。在5-LO代谢途径中, 槲皮苷起主要抑制作用, 此结果与Ribeiro等[5]认为槲皮苷是良好的5-LO抑制药结论相符。细胞实验中, ELISA法检测TNF-α结果表明, 在相同条件刺激下, 槲皮苷25 ~ 200 mg·L-1浓度组在24、48 h时的抑制效果较总黄酮明显。由此可推测, 槲皮苷通过下调COX-2/5-LO活性, 减少炎症介质的分泌, 达到抗炎的效果, 加之其毒性作用小, 有望成为具有明显抗炎活性的先导化合物, 为揭示新疆圆柏抗炎作用以及其抗类风湿性关节炎的物质基础提供了理论依据。
| [1] | 胡曦丹, 王卓. 选择性环氧合酶-2(COX-2)非甾体抗炎药的安全性与有效性[J]. 药学服务与研究, 2016, 16(2): 81-5. Hu X D, Wang Z. The safety and efficacy of the non-steroidal anti-inflammatory drugs, the cyclooxygenase-2 selective inhibitor[J]. Pharm Care Res, 2016, 16(2): 81-5. |
| [2] | 刘勇民. 维吾尔药志(上册)[M]. 第1版. 乌鲁木齐: 新疆人民出版社, 1999: 550-2. Liu Y M. Uygur Medicine Chronicles[M]. First edition. Urumqi: Xinjiang People's Publishing House, 1999: 550-2. |
| [3] | Naesdal J, Brown K. NSAID-associated adverse effects and acid control aids to prevent them[J]. Drug Safety, 2006, 29(2): 119-32. doi:10.2165/00002018-200629020-00002 |
| [4] | 徐艺荣. 九种黄酮类对LPS诱导的RAW264. 7细胞PGE2、COX-2表达的影响[D]. 天津: 天津科技大学, 2012. Xu Y R. Comparison of inhibitory effects of nine flavonoids on prostaglandin E2 production and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW264. 7 macrophage[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2012. |
| [5] | Ribeiro D, Freitas M, Tome S M, et al. Inhibition of LOX by flavonoids:a structure-activity relationgship study[J]. Eur J Med Chem, 2014, 72: 137-45. doi:10.1016/j.ejmech.2013.11.030 |