消化道肿瘤是人类面临的重大难题, 原发性肝癌是消化系统肿瘤的重要构成, 其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)。HCC全球发病率及死亡率均居于前列, 起病隐匿, 初期症状不典型, 一经发现多进展为中晚期, 且增殖旺盛、侵袭迁移能力强, 治疗手段有限, 这些导致其预后极差, 治疗现状不容乐观。因此, 寻找HCC治疗的新靶点具有重要的临床价值及科学意义[1]。研究发现, HCC的发生发展和缝隙连接蛋白(connexin, Cx)功能异常有关[2]。Cx作为缝隙连接(gap junction, GJ)的结构蛋白, 可以通过GJ依赖性和非GJ依赖性方式, 对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用[3]。Cx32是人类肝脏中主要表达的Cx亚型蛋白, 也是肝细胞GJ的主要组分[2]。一般认为Cx32为肿瘤抑制基因[4], 肝细胞的癌变过程伴随有Cx32的减少或缺失[5]; 而向HCC细胞过表达Cx32, 肿瘤细胞生长、增殖和转移能力呈负性调控[6]。但研究同时发现, Cx32在细胞质的异位蓄积也会促进HCC的进展[7]。此外, 近年来也有资料显示, Cx在某些情况下可能有利于肿瘤的进展[3]。可见Cx32与HCC生物学行为之间的关系及分子机制尚需进一步阐明。本研究通过构建LV5-hCx32慢病毒载体, 并将其导入人肝癌Huh7细胞系, 建立稳定过表达Cx32的Huh7细胞株, 不仅为进一步研究Cx32及其组成的GJ在HCC中的生物学功能提供有力的工具, 也将为基于Cx的靶点药物研究奠定实验基础。
1 材料与方法 1.1 材料大肠杆菌TOP10、人胚肾293T细胞及人肝癌细胞Huh7由本实验室保存; LV5-GFP及包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)购自苏州吉玛基因股份有限公司; NotⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA连接酶及DNA marker购于Fermentas公司; DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、普通DNA产物回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司; TRIzol、Lipofectamine 2000、Opti-MEM、DAPI及钙黄绿素(calcein-AM)购于Invitrogen公司; Cx32、GAPDH引物由苏州吉玛基因股份有限公司合成; 逆转录试剂盒及PCR所用酶、buffer、dNTP等均购于Promega公司; DMEM干粉、胎牛血清及胰蛋白酶购自Gibco公司; 无水乙醇、异丙醇、溴化乙锭、Polybrene、嘌呤霉素、MTT、结晶紫及鼠抗人Cx32抗体购于Sigma公司; 鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP及FITC标记的二抗购自Amersham公司; BSA蛋白定量试剂盒及丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺均为Bio-Rad公司产品; ECL-plus化学发光试剂盒购自Millipore公司。
1.2 方法 1.2.1 目的基因片段的获取和扩增参照GenBank中人Cx32 mRNA的CDS全长序列(NM_001097642.2), 利用全基因合成方法获得基因片段, 由苏州吉玛基因股份有限公司合成, 并在目的基因上、下游引物分别加上NotⅠ和Bam HⅠ及保护碱基, 以此为模板进行PCR扩增。反应条件为:95℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环; 最后72℃延伸5 min, 扩增片段经琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。
1.2.2 LV5-GFP-hCx32重组质粒构建扩增和鉴定使用NotⅠ和Bam HⅠ分别双酶切目的基因hCx32及LV5空载体, DNA连接酶在连接缓冲液中22℃连接2 h。连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞TOP10, 收集转化后的菌液, 涂布在含50 mg·L-1氨苄青霉素的LB培养皿上, 37℃倒置培养12~16 h, 挑取阳性菌落, 扩增进行质粒酶切鉴定, 小量抽提质粒, 送苏州吉码基因股份有限公司测序鉴定, 获取重组质粒LV5-hCx32。
1.2.3 重组慢病毒及阴性对照慢病毒的包装和浓缩转染前24 h, 将生长状态良好的293T细胞胰酶消化, 重悬接种于15 cm培养皿中, 待细胞密度达到50%时, 将重组慢病毒质粒LV5-hCx32和包装质粒经Lipofectamine 2000共转染至293T细胞中, 用无血清DMEM培养基培养6 h后, 换成含10% FBS的DMEM培养基培养。72 h后收集病毒上清液, 4℃、4 000 r·min-1离心4 min; 低速离心后, 用0.45 μm过滤器过滤, 滤液经4℃、20 000 r·min-1超速离心2 h, 收集浓缩液-80℃保存。重组慢病毒颗粒命名为LV5-GFP-hCx32, 用上述相同方法获得阴性对照LV5-NC慢病毒颗粒。
1.2.4 病毒滴度测定293T细胞培养至80%~90%融合, 胰酶消化重悬细胞, 按每孔0.5×105~1×105的密度接种至96孔板, 每孔体积100 μL, 培养24 h。取慢病毒原液10~20 μL, 用10% FBS的DMEM培养液10倍稀释3~5个梯度, 吸去96孔板中的培养液, 每孔加入500 μL稀释的病毒液, 同时设立空白对照组, 于37℃、5% CO2培养24 h; 吸弃96孔板中的稀释病毒液, 每孔加入1 mL 10% FBS的DMEM培养液, 37℃、5% CO2继续培养24 h。通过荧光显微镜计数荧光细胞, 结合稀释倍数计算病毒滴度。
1.2.5 重组慢病毒及阴性对照慢病毒转染目的细胞Huh7将对数生长期的Huh7细胞, 以2.5×105/孔密度接种于24孔板, 每孔0.5 mL, 培养24 h后, 细胞融合率达40%~60%, 吸去细胞上清, 加入培养基360 μL、40 μL不同梯度的病毒液(慢病毒原液达1011 TU·L-1)及5 mg·L-1的Polybrene, 每组3个复孔, 以Lipofectamine 2000将质粒感染Huh7细胞, 8~12 h后观察细胞状态, 待细胞状态与未感染组无明显差异时, 24 h后更换为新鲜培养基培养, 72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况, 确认目的细胞的感染方法和感染参数。
1.2.6 嘌呤霉素筛选浓度的确定取对数生长期的Huh7细胞, 胰酶消化, 计数板计数, 以1.5×105/孔密度接种于24孔板, 培养24 h, 梯度加入嘌呤霉素, 其浓度分别为0.25、0.5、0.75、1 mg·L-1, 同时设置Blank孔, 37℃、5% CO2培养箱培养, 筛选7 d后, 观察每孔细胞死亡情况, 将杀死全部细胞的最小浓度确定为稳定转染细胞株的筛选浓度。
1.2.7 稳定转染细胞株Huh7的筛选及建立Huh7细胞经脂质体瞬时转染24 h后消化传代, 以10个/cm2接种至10 cm培养皿, 继续培养24 h后, 更换为含上述确定的筛选浓度的嘌呤霉素培养液进行筛选。10~20 d后, LV5-hCx32质粒组和LV5-NC阴性对照质粒组均可见抗性克隆形成, 未转染组细胞全部死亡。以无菌克隆环挑取单细胞阳性克隆, 消化传代并扩大培养, 2~3周后可获得目标细胞系。
1.2.8 qRT-PCR检测Cx32 mRNA表达按照操作说明, 使用TRIzol提取细胞总RNA并测定RNA浓度。以1 μg RNA为模板, 按照RT-PCR逆转录试剂盒操作说明合成cDNA, 以2 μL cDNA为模板, 进行PCR反应。反应条件:95℃ 3 min预变性, 95℃ 30 s变性, 62℃ 40 s退火, 72℃ 30 s延伸, 40个循环; 最后72℃延伸5 min。引物序列Cx32-F:5′-GCGTGAACCGGCATTCTA-3′, Cx32-R:5′-CCCTCAAGCCGTAGCATTT-3′(产物大小295 bp); GAPDH-F:5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′, GAPDH-R:5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′(产物大小113 bp)。
1.2.9 Western blot检测Cx32蛋白表达实验操作参照既往文献[8]进行。每孔上样蛋白量50 μg, Cx32一抗(1 :500), 置摇床4℃过夜; 洗膜后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1 :1 000), 室温振摇2 h; 洗膜后, 用化学发光检测试剂盒(ECL)化学发光自显影, Quantity One软件分析, 以β-actin为内参照, 蛋白表达强度以Cx32蛋白表达灰度值与β-actin灰度值的比值计算。
1.2.10 免疫荧光法检测Cx32蛋白定位实验步骤参照本实验室既往研究[8]。其中Cx32一抗工作浓度1 :200(以2% BSA稀释), FITC标记的二抗工作浓度1 :200(以2% BSA稀释)。DAPI染核5 min, 95%甘油封片剂封闭, 倒置荧光显微镜下观察拍照。
1.2.11 细胞接种荧光示踪法测定Huh7细胞间GJ功能使用本领域之前报道的方法测定GJ功能[8-9]。具体原理包括“供体细胞”和“受体细胞”, 其中“供体细胞”经过荧光指示剂calcein-AM预处理30 min, 该荧光染料能被胞内脂酶水解而形成发绿色荧光的calcein, calcein分子质量足够小, 能经GJ传递至邻近细胞。以1 :200的比例将“供体细胞”接种到已生长融合的Huh7“受体细胞”上。培养4 h, 待“供体细胞”与“受体细胞”间形成稳定的GJ后, 在倒置荧光显微镜下, 计数一个“供体细胞”周围含有绿色荧光的“受体细胞”的数目, 作为GJ功能指标。
1.2.12 MTT法检测细胞增殖能力将经过不同处理的Huh7细胞接种于96孔板中, 培养相应时间, 每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL, 避光温育4 h。终止培养, 弃上清, 每孔加150 μL DMSO, 振荡10 min, 使结晶物充分溶解, 用酶标仪在490 nm波长处测定OD值。
1.2.13 克隆形成实验取对数生长期的各组细胞, 用胰蛋白酶消化后, 制备成单细胞悬液, 计数, 以500个/孔的密度接种于6孔板, 置37℃、5% CO2及饱和湿度环境下培养10~14 d。多聚甲醛固定细胞, 结晶紫染色10 min, 清洗干燥后计数克隆, 并进行拍照。实验设置3孔并重复3次。
1.2.14 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对各数据进行分析, 统计数据以x±s表示, 均值比较采用两独立样本t检验。
2 结果 2.1 LV5-GFP-hCx32慢病毒载体的鉴定质粒酶切鉴定结果显示, 扩增出大小为852 bp的Cx32基因片段, 和大小为9 337 bp的LV5基因片段(Fig 1A)。测序结果证实, 所获得的表达质粒目的片段与预期完全相符(Fig 1B)。表明LV5-hCx32慢病毒表达载体构建成功。
|
| Fig 1 Identification of recombinant lentiviral plasmid A:The result of enzyme digestion.1:Marker; 2:Enzyme-digested product of the recombinant plasmid LV5-hCx32(NotⅠ/Bam HⅠ); B:Partial sequence diagram of LV5-GFP-hCx32 and the NCBI database matching results. |
将慢病毒包装三质粒系统的DNA转染293T细胞, 培养72 h后, 倒置显微镜下观察, 可见GFP绿色荧光, 表明慢病毒包装成功。根据病毒滴度计算公式, 计算出浓缩后LV5-hCx32及LV5-NC慢病毒滴度约为3×1011 TU·L-1, 能够满足实验对病毒液滴度的要求。
2.3 LV5-GFP-hCx32载体及对照载体感染Huh7细胞的效率将成功包装的重组慢病毒载体(LV5-GFP-hCx32)和阴性对照载体(LV5-GFP-NC)感染Huh7细胞, 72 h通过荧光显微镜观察细胞感染效率。预实验结果表明, 当慢病毒的滴度达到3×1011 TU·L-1, 按1 :10稀释感染, 细胞感染效率达到80%左右(Fig 2), 因此, 选择将病毒液以MOI 20感染靶细胞。
|
| Fig 2 Transient transfection of Huh7 cells with LV5-GFP-hCx32 recombinant lentiviral plasmid(×100) A:Transfection of 3×1011 TU·L-1 lentivirus diluted at 1 :10 with 72 h; B:Transfection of 3×1011 TU·L-1 lentivirus diluted at 1 :50 with 72 h. |
qRT-PCR结果显示, 与未转染组相比, LV5-NC瞬时感染组Cx32 mRNA表达无明显变化, 但LV5-hCx32瞬时感染组Cx32 mRNA表达是其214.4倍(Fig 3A)。同时, Western blot检测结果也显示, LV5-NC空质粒和LV5-hCx32质粒瞬时转染组的细胞内均有Cx32蛋白表达, 但LV5-hCx32质粒转染组Cx32蛋白表达明显高于空质粒转染组, 约为空质粒组的13.3倍(Fig 3B)。
|
| Fig 3 Expression of Cx32 in Huh7 cells after transient transfection with LV5-hCx32 and LV5-NC plasmid(n=3) A:qRT-PCR was used to detect the mRNA level of Cx32;B:Western blot was used to measure the protein expression of Cx32.**P < 0.01 vs control or LV5-NC. |
经不同浓度嘌呤霉素筛选7 d后, 在显微镜下观察细胞的死亡情况, 发现0.75 mg·L-1以及更高浓度的嘌呤霉素可将细胞全部杀死, 最终确定嘌呤霉素筛选浓度为0.75 mg·L-1(Fig 4)。
|
| Fig 4 The Huh7 cells after selection with different concentrations of puromycin for 7 days(×100) A:Puromycin 0.25 mg·L-1; B:Puromycin 0.5 mg·L-1; C:Puromycin 0.75 mg·L-1; D:Puromycin 1.0 mg·L-1 |
向感染LV5-NC和LV5-hCx32慢病毒的Huh7细胞中加入0.75 mg·L-1的嘌呤霉素进行不断筛选, 阳性细胞克隆在20余次传代后全部稳定存活, GFP表达情况如Fig 5所示。
|
| Fig 5 Stable transfection of Huh7 cells with LV5-GFP-hCx32 and LV5-GFP-NC recombinant lentiviral plasmids(×100) |
qRT-PCR和Western blot检测结果显示, 与LV5-NC稳定转染Huh7对照细胞相比, LV5-hCx32稳定转染细胞Cx32 mRNA和蛋白表达水平均明显增加, 分别是对照组的72.5倍和9.3倍(Fig 6A、6B)。免疫荧光实验进一步表明, 该细胞内Cx32弥散分布于细胞质中, 仅有少量呈细颗粒状定位于细胞膜上; LV5-hCx32组细胞Cx32荧光量明显增强, 且增加的Cx32有定位于细胞膜上的潜力(Fig 6C), 形成GJ的能力增强(Fig 6D), 表明稳定高表达hCx32的Huh7细胞模型构建成功。
|
| Fig 6 Cx32 expression, localization and GJ status in Huh7 cells after stable transfection with LV5-hCx32 and LV5-NC plasmid(n=3) A:qRT-PCR was used to detect the mRNA level of Cx32;B:Western blot was used to measure the protein expression of Cx32;C:Immunofluorescent staining showed diffuse cytoplasmic but only a partial membranous Cx32 expression(marked by red arrow) in Huh7 cells, and more membranous localization of Cx32 was observed by Cx32 transfection(marked by red arrow)(×400);D:Fluorescence images showed an enhanced dye coupling(GJ activity) between adjacent Huh7 cells(×200).*P < 0.05, **P < 0.01 vs LV5-NC. |
MTT结果表明, LV5-NC对照组与空白组细胞的增殖能力在各时间段均无明显差异, 而LV5-hCx32组细胞的增殖能力明显减弱(Fig 7A)。同样的结果在克隆形成实验中也得到证实(Fig 7B)。表明稳定高表达Cx32对肝癌Huh7细胞的增殖能力有抑制作用。
|
| Fig 7 Effect of overexpressed Cx32 on cell proliferation in Huh7 cells(n=3) A:MTT assay was used to detect the absorbance at 490 nm; B:Colony formation assay was used to determine the cellular proliferation capacity.**P < 0.01 vs control or LV5-NC. |
恶性肿瘤是威胁人类健康的头号杀手, 随着肿瘤研究的不断深入, 人们开始从分子生物学角度去审视其发生机制。基因的突变、组织细胞的逆分化、免疫监视的缺失等导致细胞出现失控性、异质性增长, 进而引发一系列恶果。靶向治疗则是在细胞分子水平, 针对已经明确的致癌位点, 设计的识别和攻击肿瘤细胞的新兴治疗手段, 其高效、特异、低毒等特点彻底颠覆了传统的治疗模式, 开启了肿瘤治疗的新篇章。HCC是一种具有高侵袭转移能力的恶性肿瘤, 其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势。索拉非尼作为晚期HCC的一线治疗方案并没有取得令人满意的疗效[10], 而其他靶向药物在临床试验阶段均遭遇失败[11]。因此, 探索HCC发生发展机制, 寻找HCC治疗的新靶点迫在眉睫。
GJ是位于两个相邻细胞之间的一种蛋白质连接通道, 通过直接介导细胞之间的物质转运及信号转导, 参与调节细胞的生长、分化及凋亡。Cx32是肝脏GJ的主要组成蛋白[2], 与其他Cx(如Cx26、Cx43等)协同完成肝细胞间一系列生理过程。肝脏中Cx结构功能的变化, 可能会导致GJ通道通透性和对通透物质选择性的改变, 进而影响细胞间的物质交换和信号传递, 最终导致细胞功能异常。如Cx32基因缺陷小鼠易受到物理辐射及化学毒物损伤, 引发肝脏恶性肿瘤的发生[12]; 正常肝细胞向HCC的演变过程中伴随Cx32表达量的下调及GJ功能的失调[5]; 而体外向HCC细胞转染Cx32上调GJ则能抑制癌细胞增殖和克隆形成[6]。Cx32参与调控HCC机制可能为有功能的Cx32表达数量减少, 不能形成有效的GJ通道, 导致恶性启动细胞失去周围正常细胞对其的调控, 细胞失控性增长, 引发肿瘤并不断进展。然而, Cx及其构成的GJ作为肿瘤抑制基因的传统理念受到了挑战[3]。有研究发现, Cx通过增加血管侵袭力, 促进乳腺癌及恶性黑色素瘤脑转移的发生[13]; 其在肿瘤患者淋巴结转移灶中高表达, 并与不良预后有关[14-15]。研究还显示, Cx32在HCC细胞质中的异位蓄积能够加强肿瘤细胞自我更新, 从而加剧其恶性生物学行为[7]。由此可见, 在Cx32与HCC纷杂的关系网络中, 二者之间的联系以及关联机制尚需进一步研究。
GJ特异性工具药物的缺乏, 是阻碍当前GJ研究及其与HCC治疗相关性认识的主要障碍。因此, 建立一种可特异性调控Cx32及其组成GJ的HCC细胞模型, 对于阐明Cx32在HCC发生发展中的作用及机制尤为必要。慢病毒以其高效地转染各个分裂时相细胞、特异地调控目的基因表达水平等特点, 被广泛应用于基因功能鉴定及分子生物学研究领域, 并在脑、肺、肝及造血干细胞等疾病的潜在靶点研究中扮演重要的角色, 已成为人类基因治疗的有效工具。本研究将PCR扩增所得Cx32基因片段重组至LV5-GFP载体, 经过酶切、连接及测序验证, 转染293T细胞进行病毒包装, 成功获得病毒滴度为3×1011 TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32, 感染Huh7细胞, 并经嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆, 分子生物学方法证实该细胞亚系Cx32稳定高表达, 高表达的Cx32大部分分布于细胞质, 小部分定位于细胞膜, 这些定位于细胞膜的Cx32蛋白有形成GJ的能力。Cx32特异性过表达对Huh7细胞生长及增殖能力有明显的抑制作用, 与既往的报道结果较为一致[6], 其机制不排除GJ依赖性和非GJ依赖性的综合作用。研究结果综合表明稳定过表达Cx32的人肝癌Huh7细胞系被成功构建。
综上所述, 充分理解Cx32及其组成GJ参与HCC的分子机制是未来HCC靶向药物研发的新视角, 建立稳定调控Cx32的细胞模型是研究最为理想的手段之一。本研究通过LV5慢病毒表达载体, 成功构建了稳定过表达Cx32的Huh7细胞模型, 且过表达的Cx32蛋白可以明显抑制Huh7细胞的增殖能力。该工具细胞将为后续揭示Cx32在HCC中的生物学效应提供有力的实验手段, 也为发展以GJ为靶点的新型药物提供线索和依据。
| [1] | 夏丽洁, 张富春. 肝癌治疗新靶点GPC3研究进展[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(11): 1486-9. Xia L J, Zhang F C. Research progress of a new therapeutic target in hepatocellular carcinoma glypican-3[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(11): 1486-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.002 |
| [2] | Vinken M, De Kock J, Oliveira A G, et al. Modifications in connexin expression in liver development and cancer[J]. Cell Commun Adhes, 2012, 19(3-4): 55-62. doi:10.3109/15419061.2012.712576 |
| [3] | Naus C C, Laird D W. Implications and challenges of connexin connections to cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10(6): 435-41. doi:10.1038/nrc2841 |
| [4] | Fujimoto E, Sato H, Shirai S, et al. Connexin32 as a tumor suppressor gene in a metastatic renal cell carcinoma cell line[J]. Oncogene, 2005, 24(22): 3684-90. doi:10.1038/sj.onc.1208430 |
| [5] | Nakashima Y, Ono T, Yamanoi A, et al. Expression of gap junction protein connexin32 in chronic hepatitis, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2004, 39(8): 763-8. |
| [6] | Zhao B, Zhao W, Wang Y, et al. Connexin32 regulates hepatoma cell metastasis and proliferation via the p53 and Akt pathways[J]. Oncotarget, 2015, 6(12): 10116-33. |
| [7] | Kawasaki Y, Omori Y, Li Q, et al. Cytoplasmic accumulation of connexin32 expands cancer stem cell population in human HuH7 hepatoma cells by enhancing its self-renewal[J]. Int J Cancer, 2011, 128(1): 51-62. doi:10.1002/ijc.v128:1 |
| [8] | 杨燕, 李玉梅, 张娜, 等. 缝隙连接蛋白26在肝细胞癌组织的表达及意义[J]. 浙江大学学报, 2015, 44(5): 517-24. Yang Y, Li Y M, Zhang N, et al. Expression of gap junction protein connexin26 in human hepatocellular carcinoma and its significance[J]. J Zhejiang Univ(Med Sci), 2015, 44(5): 517-24. |
| [9] | 阳洁, 覃贵慧, 陈军泽. 慢病毒靶向干扰Cx26抑制人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(7): 937-41. Yang J, Qin G H, Chen J Z. Inhibitory effect of lentivirus targeting interference Cx26 on proliferation and migration of human highly metastatic hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(7): 937-41. |
| [10] | Llovet J M, Ricci S, Mazzaferro V, et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma[J]. N Engl J Med, 2008, 359(4): 378-90. doi:10.1056/NEJMoa0708857 |
| [11] | Llovet J M, Hernandez-Gea V. Hepatocellular carcinoma:reasons for phase Ⅲ failure and novel perspectives on trial design[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(8): 2072-9. doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0547 |
| [12] | Igarashi I, Makino T, Suzuki Y, et al. Background lesions during a 24-month observation period in connexin 32-deficient mice[J]. J Vet Med Sci, 2013, 75(2): 207-10. doi:10.1292/jvms.12-0280 |
| [13] | Stoletov K, Strnadel J, Zardouzian E, et al. Role of connexins in metastatic breast cancer and melanoma brain colonization[J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 4): 904-13. |
| [14] | Ito A, Koma Y, Uchino K, et al. Increased expression of connexin 26 in the invasive component of lung squamous cell carcinoma:significant correlation with poor prognosis[J]. Cancer Lett, 2006, 234(2): 239-48. doi:10.1016/j.canlet.2005.03.049 |
| [15] | Kanczuga-Koda L, Sulkowska M, Koda M, et al. Increased expression of gap junction protein-connexin 32 in lymph node metastases of human ductal breast cancer[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2007, 45(Suppl 1): S175-80. |