2. 筋骨理论与治法教育部重点实验室, 上海 200032;
3. 上海中医药大学脊柱病研究所, 上海 200032
2. Key Lab of Ministry of Education (Theory and Therapy of Muscles and Bones), Shanghai 200032, China;
3. Institute of Spine Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
颈椎病发病率逐年上升, 发病趋于年轻化, 已成为威胁成年人健康的主要疾病之一, 给患者的工作生活带来了严重不便。颈椎病的主要病理基础是椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD), 中医认为, “气虚血瘀”是椎间盘退变的病机[1]。迄今为止, IVDD的病理机制仍不十分清楚。前期体外实验已证明, 桃仁、红花中主要单体苦杏仁苷及羟基红花黄色素A可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞退变[2-5]。王拥军等[6]首次建立的动静力失衡性椎间盘退变大鼠模型是研究IVDD常用的动物模型。本文主要探讨中药经典活血化瘀药对桃仁-红花, 对动静力失衡性椎间盘退变大鼠软骨胞外基质的影响及对IVDD的治疗作用, 为颈椎病的防治提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物Wistar ♂大鼠50只, 清洁级, 8周龄, 平均体质量210 g左右, 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 许可证:SYXK(沪)2015-0008, 饲养于上海市公共卫生临床中心, 自由饮水摄食。
1.2 药物与试剂中药桃仁、红花, 购自龙华医院中药房; 盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业); Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)兔抗鼠多克隆抗体(BA0533)、Ⅹ型胶原(typeⅩ collagen, Col Ⅹ)兔抗鼠多克隆抗体(BA2023)、即用型山羊抗兔SABC免疫组化染色试剂盒, 均购自武汉博士德生物工程有限公司; TRIzol(美国Invitrogen); 反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq(RR420A)购自TaKaRa公司; Col Ⅱ、Col Ⅹ、β-actin引物均由北京华大基因公司合成; 阿尔新蓝(Alcian blue)、苏木精(Hematoxylin)、伊红(Eosin Y)、Orange G、Phloxin B, 均购自美国Sigma公司。
1.3 仪器TP1020全自动组织脱水机、EG1160石蜡包埋机、RM2235石蜡切片机(德国Leica); BX50激光共聚焦显微镜(日本Olympus); C1000 Thermal Cycler实时定量PCR仪(美国Bio-Rad); Centrifuge 5417R高速离心机(德国Eppendorf)。
1.4 方法 1.4.1 动物的分组及模型的建立将大鼠适应性喂养1周后, 编为1~50号, 采用随机数字表法分组, 每组10只。分为对照组、模型组、假手术组、美洛昔康组、桃仁-红花药对组, 编号后分笼饲养。动静力失衡性大鼠椎间盘退变模型参考王拥军等[6]的方法造模:将大鼠(模型组、美洛昔康组、桃仁-红花药对组)进行盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉, 麻醉用量0.1 g·kg-1, 剪除大鼠颈后部毛, 碘伏消毒后, 由颈后正中做2~2.5 cm长纵向切口, 切开皮肤, 各层肌肉充分游离, 横向切断头、颈、寰最长肌以及深层颈夹肌, 将颈髂肋肌和头半棘肌完全切除, 依次剪断C2~C7椎间盘的棘上和棘间韧带。彻底止血, 庆大霉素冲洗后缝合皮肤, 红霉素软膏外涂切口, 防止感染。假手术组切开皮肤后不做任何处理, 庆大霉素冲洗后直接缝合, 切口处涂红霉素软膏。
1.4.2 动物给药术后12周, 各给药组开始灌胃30 d, 用药剂量根据《实验动物药理学》中动物表面积比率换算计量法计算。按照成年人每日用药剂量标准换算(成年人按标准体质量60 kg计算, 大鼠平均体质量按370 g计算), 得出大鼠给药剂量。桃仁-红花煎剂以及双蒸水溶解的美洛昔康悬浊液按剂量每日1次灌胃给药, 连续给药30 d。模型组于造模后与对照组及假手术组按照同等剂量生理盐水灌胃30 d。
1.4.3 标本处理大鼠于给药30 d后全部处死, 取C4/5、C6/7椎间盘标本, C6/7椎间盘置于-80℃冰箱保存。C4/5椎间盘置于质量浓度为40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h, 清水冲洗30 min, 质量浓度为140 g·L-1的EDTA溶液脱钙4周, 每2 d换1次脱钙液, 脱水处理后石蜡包埋, 5 μm正中矢状位连续切片。
1.4.4 ABOG染色每个标本抽取2张切片脱蜡至水, Alclan Blue/Hematoxylin混合染液30 min, 盐酸乙醇分化3 s, 氨水返蓝15 s, Eosin Y/Orange G/Phloxin B混合染液1.5 min, 乙醇梯度脱水后二甲苯透明, 中性树胶封片, 显微镜下观察椎间盘组织形态学改变。
1.4.5 免疫组化染色每个标本随机抽取2张进行脱蜡至水, 体积分数为0.03的H2O2灭活过氧化物酶15 min, BSA封闭10 min, 一抗4 ℃孵育过夜, SABC 10 min后DAB显色, 苏木精1 min染核, 盐酸乙醇分化5 s后氨水返蓝, 中性树胶封片, 显微镜下观察Col Ⅱ、Col Ⅹ的表达。
1.4.6 实时定量PCR检测提取总mRNA:分离C6/7椎间盘软骨终板, 置于研钵中加液氮研磨至粉末, 加入1 mL TRIzol混匀, 冰上静置5 min, 加氯仿200 μL后震荡, 冰上静置20 min, 14 000 r·min-1、4℃离心15 min, 吸上清, 加入500 μL预冷异丙醇, 冰上静置10 min, 14 000 r·min-1、4℃离心15 min, 弃上清, 加体积分数为0.75的乙醇500 μL洗涤, 9 200 r·min-1、4℃离心5 min, 室温静置10 min, 空气干燥RNA沉淀后溶解于30 μL DEPC水, 测RNA浓度; 逆转录cDNA:配20 μL逆转录反应体系, 于30℃孵育15 min, 85℃ 5 s, 终止反应; 实时定量PCR检测mRNA表达:SYBR Premix Ex Taq 10 μL, RNase-free水7 μL, 上、下游引物(引物序列见Tab 1)各1 μL, 模板cDNA 1 μL, 配制20 μL的反应体系。95 ℃预变性3 min, 进入循环, 95℃变性10 s, 58℃退火10 s, 72℃延伸30 s的条件下循环扩增, 循环次数均为40次。同一样本同时做β-actin内参PCR反应, 设置3个复孔。待反应结束后, 以每个样本所含检测的基因mRNA的拷贝数和其对应的β-actin内参基因的拷贝数的比值进行比较。
| Gene | Primer sequence |
| Col Ⅱ | Forward:5’-TCCTAAGGGTGCCAATGGTGA-3’ |
| Reverse:5’-AGGACCAACTTTGCCTTGAGGAC-3’ | |
| Col Ⅹ | Forward:5’-TTCACAAAGAGCGGACAGAGA-3’ |
| Reverse:5’-TCAAATGGGATGGGAGCA-3’ | |
| β-actin | Forward:5’-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3’ |
| Reverse:5’-CGACGAGCGCAGCGATA-3’ |
用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 计量资料均以x±s表示, 各组间差异显著性检验用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果 2.1 桃仁-红花药对对椎间盘组织形态学的影响对照组C4/5椎间盘ABOG染色展现清晰的椎间盘界限, 椎间盘中央区髓核可见清晰的基质。模型组染色呈现出椎间盘退变的表现, 椎间盘高度降低(Fig 1), 髓核基质减少, 纤维环出现环形裂隙, 软骨界限模糊、基质丢失, 并出现软骨终板骨化, 其中含骨髓样组织。而假手术组、美洛昔康组及桃仁-红花药对组椎间盘髓核及软骨与对照组相近(Fig 2)。
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| Fig 1 Height of intervertebral disc **P < 0.01 vs model |
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| Fig 2 The morphological changes of rat intervertebral disc by ABOG staining (×200) A:Control group; B:Model group; C:Sham group; D:Meloxicam group; E:Taoren-Honghua group |
Col Ⅱ主要表达于软骨细胞基质中, 模型组Col Ⅱ染色强度明显低于对照组, 而桃仁-红花药对组Col Ⅱ表达高于模型组。Col Ⅹ于软骨细胞基质中表达, 模型组可见Col Ⅹ阳性染色, 对照组及桃仁-红花药对组Col Ⅹ表达明显少于模型组(Fig 3)。
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| Fig 3 Col Ⅱ and Col Ⅹ expression levels in rat degenerated intervertebral discs by immunohistochemistry A:The positive cells were measured by DAB and observed by microscopy(×200).a:Control group; b:Model group; c:Sham group; d:Meloxicam group; e:Taoren-Honghua group; B:Positive cell counts of Col Ⅱ and Col Ⅹ in per sight.**P＜0.01 vs model. |
如Fig 4所示, 与对照组相比, 模型组椎间盘软骨细胞中Col Ⅱ表达降低, Col Ⅹ表达升高。与模型组比较, 桃仁-红花药对组椎间盘软骨细胞中Col Ⅱ表达上调, Col Ⅹ表达下调。
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| Fig 4 The relative expression of Col Ⅱ(A) and Col Ⅹ(B) mRNA **P＜0.01 vs model |
中医理论认为椎间盘退变的根本原因是“气虚血瘀, 本虚标实”, 益气化瘀的方剂及拆方对椎间盘退变有一定的治疗效果。中国药典提示, 桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘、润肠通便之功效, 红花兼散瘀止痛、活血通经之功效[7]。桃仁-红花药对最早出自清·吴谦《医宗金鉴·四十四卷》中的方剂桃红四物汤, 是中药治疗活血化瘀类疾病的经典配伍。通过对桃仁-红花药对在中药方剂中应用规律的总结, 发现两味药比例1 :1出现的频次最多, 对临床用药有重要指导意义[8]。
椎间盘是人体中最大的无血管组织, 主要靠纤维环外周通路以及软骨终板通路进行营养的供给和废物的代谢, 软骨终板胞外基质的生成与维持直接影响椎间盘的生物化学及生物力学功能。Col Ⅱ是组成固体基质的最主要部分, 其含量直接影响胞外基质的生物学功能[9], 而Col Ⅹ特异表达于肥大软骨细胞中, 与基质降解相关[10]。胞外基质合成减少及降解加速是导致软骨细胞退变的重要原因之一, 软骨细胞的退变在椎间盘退变进程中发挥重要作用[11-12]。
本研究通过建立动静力失衡性椎间盘退变大鼠模型, 运用ABOG染色分析桃仁-红花药对煎剂对椎间盘退变中软骨终板细胞外基质产生的影响, 发现与模型组相比, 桃仁-红花药对组软骨终板基质染色较深, 表明其胞外基质含量较高, 证明桃仁-红花药对可有效抑制退变椎间盘中软骨细胞外基质的降解。免疫组化检测发现, 模型组能够明显上调Col Ⅹ的表达, 同时下调Col Ⅱ的表达, 桃仁-红花药对组能抑制Col Ⅹ的表达, 同时上调Col Ⅱ的表达。因此, 进一步采用实时定量PCR检测各组Col Ⅱ、Col Ⅹ mRNA表达情况, 结果发现, 模型组Col Ⅹ mRNA表达明显增加, Col Ⅱ mRNA表达明显减少, 桃仁-红花药对组能够明显下调Col Ⅹ mRNA表达, 上调Col Ⅱ mRNA表达。我们可以得出, 桃仁-红花药对可以减少动静力失衡性椎间盘退变大鼠椎间盘软骨基质的降解, 抑制软骨细胞退变, 进而延缓椎间盘退变, 起到了椎间盘保护作用。
颈椎病的预防及早期干预越来越受到重视, 活血化瘀类中药用于临床延缓颈椎病早期椎间盘退变的疗效亟待探索, 而该药对能否有效防治腰椎疾病、骨关节炎等其他慢性骨关节病也是值得我们未来深入研究的课题。
( 致谢: 本实验在上海中医药大学脊柱病研究所筋骨理论与治法教育部重点实验室完成, 感谢实验室老师给予的技术指导以及实验室同学给予的大力帮助。)
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