随着世界人口的老龄化, 骨质疏松症(osteoporosis, OP)的发病率也逐年上升, 现已成为世界普遍关注的公共卫生问题^[1]。OP是一种以骨量及骨组织微结构异常为特征的代谢性骨病^[2], 可能导致骨脆性增加和增加骨折的风险, 对中老年人的健康构成严重威胁^[3]。目前, 治疗OP的公认药物主要包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、骨矿化物等三大类。但从药物相关的治疗效果来看, 目前仅仅局限于改善临床症状、延缓病情进展, 却不能使OP患者的骨重塑过程重新达到平衡状态, 以发挥逆转病情甚至治愈的效果; 同时, 上述药物的靶向性均不强, 因此亟需寻找新的思路解决这一问题^[4]。中药及其复方治疗OP以温补肾阳、强筋壮骨、填精生髓为主, 兼以益气养血、祛风散寒除湿、通络止痛。现代药理学研究发现^[5], 此类中药及其复方具有提高肠钙吸收、促进成骨细胞矿化、增强细胞成骨性活性、抑制破骨细胞的形成等综合功效。因此, 中药及其复方在防治OP方面具有独特优势和广阔发展前景。

淫羊藿是中医临床抗骨质疏松常用药物, 具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。研究证实, 淫羊藿对于OP具有较好的临床疗效, 能够明显改善OP症状、延缓甚至逆转OP的进程^[6], 但其药效物质基础和分子机制至今尚不明确。因此, 分析淫羊藿的有效活性成分、作用靶点及其可能的作用机制, 有利于阐述淫羊藿的科学内涵, 并促进其临床推广应用。目前, 现有的研究手段在针对中药及其复方研究方面往往存在检测灵敏度低、可靠评价指标少等问题, 以至于难以科学、有效、全面地阐释中药及其复方的作用机制。

基于系统生物学理论的建立, 网络药理学为研究中药及其复方潜在活性成分和作用靶点提供了有效的研究策略。本文针对中药单体淫羊藿中所有已报道的成分, 通过药物口服生物利用度(oral bioavailability, OB)、药物相似性(drug-likeness, DL)等方面进行系统的筛选, 进而预测可能入血的有效活性成分, 同时配合化合物相似性片分析和蛋白质相互作用网络分析的手段, 进一步预测淫羊藿治疗OP的作用靶点, 对靶点进行富集分析, 探讨其可能的作用机制。流程图见Fig 1。

Fig 1 Flow chart of molecular mechanism analysis of Epimedium in treatment of osteoporosis

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中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)作为国内相对比较完善的中药成分靶点数据库, 收录了中药约505味, 相关中药成分约为12 144个, 同时对每个成分毒药物动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)参数进行了详细的描述, 例如OB、DL、Caco-2细胞渗透性、半衰期、血脑屏障、脂水分布系数等。本研究通过检索TCMSP, 对淫羊藿所有成分数据库进行了筛选及构建, 其中筛选条件为OB≥30%, DL≥0.18。同时, 结合前期研究结果, 将获取的活性成分与文献比对, 并采用TCMSP靶点预测模型对相关活性成分作用靶点加以预测。

淫羊藿“活性成分-靶点网络”主要通过网络图像化软件Cytoscape 3.2.1进行构建和分析。本研究将从上述获得的活性成分及靶点关系进行导入以完成相关网络构建, 其中用“节点”(node)表示分子、靶蛋白, 用“边”(edge)表示成分与靶点之间的关系; 然后采用network analyzer插件进行网络特征分析, 以明确淫羊藿中较为重要的成分和靶点, 同时跟踪文献以分析其中的相互作用。

从GeneExpression Omnibus数据库中下载编号为:GSE7429的芯片数据原始文件, 该芯片数据的原始文件包含了20个人的血液样本, 主要针对绝经后骨密度(bone mineral density, BMD)高低不同女性血液的基因表达谱的基因测序(10个低BMD、10个高BMD), 进行了基因测序。本研究利用robust multiarray average(RMA)算法对其原始文件进行了背景校正和矩阵数据归一化处理, 同时采用limma包对芯片数据进行二次分析, 并结合P值和差异倍数(fold change, FC)的相关数值进行筛选, 其中将P＜0.01, FC＞1.5作为明显差异基因的筛选条件。

利用“osteoporosis”作为关键词, 对五大常用数据库(包括TTD、DrugBank数据库、OMIM数据库、GAD、PharmGKB等)进行已知的疾病靶点的检索及筛选。删除检索结果中重复的靶点, 即可获得OP发病过程已知的靶点。

蛋白质相互作用网络绘制主要借助于BisoGenet插件, 其中BisoGenet是由6种蛋白质相互作用关系数据库构成的, 包括Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)等。本研究将淫羊藿上述的作用靶点和OP相关的疾病靶点分别映射到蛋白质相互作用关系网络中, 利用BisoGenet插件对2个蛋白质相互作用关系网络进行绘制, 同时利用cytoscape合并2个蛋白质相互作用关系网络, 并对交集网络进行抽取, 抽取获得的交集网络即为淫羊藿治疗OP的直接和间接靶点调控网络。

结合相关文献, 并借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、紧密度、网络中心性和局部边连通性等指标, 采用网络拓扑分析插件CytoNCA筛选出自由度大于所有节点自由度中位数2倍的节点, 即“Big hubs”; 然后, 筛选网络中的关键节点, 再筛选其他几个指标大于所有节点中位数的节点, 即关键基因。上述获得的相关活血成分及靶点则有可能是直接、间接调控这些节点, 发挥抗骨质疏松的作用。

本研究采用了较为新颖的ClueGO分析插件, 对上述OP的关键靶点及获得的信号通路进行富集分析, 并根据重要程度绘制信号通路占比饼状图; 其中ClueGO插件在一定程度上可将富集分析的结果以节点的形式展现, 以充分发挥形象的图像化功能, 同一类型的信号通路采用同一种颜色的节点代表, 同时节点的大小代表了该信号通路的显著性, 信号通路的显著性越高, 节点越大, 说明该通路的重要性越高。

本研究通过对TCMSP数据库淫羊藿单味中药中所有的已报道的成分及其ADME参数的相关检索, 共搜集到成分130个。同时, 根据OB和DL参数对淫羊藿中入血的活性成分进行筛选, 共搜集到入血活性成分23个, 见Fig 2、Tab 1。利用相关靶点预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测, 排除重复靶点, 共获得预测靶点101个。

Fig 2 ADME parameter distribution of active ingredients of blood entering blood in Epimedium A:Components that meet the criteria for screening in Epimedium; B:Component ratio in accordance with the screening conditions in Epimedium.

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将上述活性成分及预测靶点采用网络图形化工具Cytoscape对潜在活性成分和作用靶点的关系网络进行绘制和分析, 以查找网络中的关键节点, 进而确定淫羊藿中发挥重要作用的成分和靶点。如Fig 3所示, 通过Cytoscape网络构建共获得110个节点和230个关系。

Fig 3 Compound-target network of Epimedium

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通过对GEO芯片数据库的基因芯片进行二次挖掘分析, 获取骨密度高低不同的骨细胞的基因表达谱中明显影响和改变的基因共124个, 进一步分析淫羊藿的作用靶点是否与这些明显改变的基因相关, 同时探讨这些基因与OP及其并发症发生、发展的相关关系。差异表达基因热图见Fig 4。

Fig 4 Different expression genes of osteoporosis

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本研究检索了5个国际公认的疾病基因相关数据库, 搜集前期研究和报道的与OP发生、发展密切相关的已知的相关靶点基因, 其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB分别检索到44、0、57、295、10个靶点, 删除重复靶点, 共检索到356个已知的OP发病过程中相关的靶点。

网络构建机体的内在调控往往不是单一的信号通路支配的, 而是复杂的调控网络。不同的信号通路和靶点之间会存在一定程度的信号转导, 故药物的治疗作用除表现为成分靶点的直接结合外, 更多见于直接调控靶点与间接调控其他靶点相结合的调控方式。而蛋白质相互作用关系数据为寻找靶点的直接、间接调控作用关系提供了可能。通过蛋白质相互作用网络的构建, 本研究发现淫羊藿可以与6 127个靶点产生直接或间接作用, 而这些靶点与靶点之间的相互联系多达148 246种。以此同时, 对OP相关的靶点绘制蛋白质相互作用网络, 也发现与OP直接或者间接相关的靶点也多达6 129个。本研究利用蛋白质相互作用网络, 进一步深入分析淫羊藿影响OP发生、发展中的靶点, 绘制蛋白质相互作用靶点网络, 为网络分析和机制的探讨提供了可能。

本研究通过对淫羊藿调控OP的蛋白质相互作用交集网络和网络节点的拓扑属性分析进行靶点筛选, 旨在寻找网络中关键节点, 并在网络中获得更多节点的传递信息和更高的节点信息传递效率, 充分发挥其在网络中重要的作用。通过网络拓扑分析, 本研究共发现关键节点221个。筛选策略示意图见Fig 5。

Fig 5 Target screening strategy for key nodes in Epimedium

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本研究对上述221个关键节点利用ClueGO进行分析, 分析其参与的主要信号通路, 研究淫羊藿治疗OP可能的作用机制。分析结果显示, 淫羊藿除与直接作用于OP关键节点涉及的信号通路, 如Wnt信号通路、TGF-β信号通路、Notch信号通路等有关, 还对PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、甲状腺素信号通路等同时进行调控(Fig 6)。

Fig 6 Enrichment analysis of Epimedium in signaling pathway in treatment of osteoporosis The enrichment analysis is represented by the pie charts(right) as generated by ClueGo and the most vital term in the group is labeled(left).

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随着全球人口数量增加, 伴随人口老龄化的加速发展, OP患者人数逐年递增, 长时间应用抗骨质疏松药物尤其是双膦酸盐的不良反应逐渐被重视^[7], 抗骨质疏松新药的研发仍不断探索^[8]。许多中药及复方在防治OP方面发挥着重要的作用。中医学认为, 肾乃先天之本, 而骨的生长、发育及衰弱均与肾精盛衰关系紧密, OP属肾虚, 因此中医治疗以补肾为主。

淫羊藿又称“三枝九叶草”, 属小蘖科淫羊藿属, 其味甘、辛, 性温, 是补肾的壮阳药, 具有强筋骨、补肾阳、祛风湿功效。淫羊藿最早出自《神农本草经》, 属中品行列, 具有补精壮体的记载, 淫羊藿在抗骨质疏松方面具有较好的临床疗效^[9-11]。本研究根据OB和DL参数, 共筛选出淫羊藿中入血的活性成分23个, 对上述活性成分进行潜在活性成分和作用靶点的关系网络绘制, 共获得110个可能的靶点和230个相互关系。“活性成分-靶点网络”分析显示, 木犀草素、槲皮素、谷甾醇、山奈酚等有效成分能作用于网络中的多个靶点, 而PPARG、ESR1、AR等靶点也能与多个成分作用。基于上述结果可知, 淫羊藿的有效成分之间存在协同, 而协同调控的靶点也在OP的发生、发展中发挥不同作用, 具有治疗OP的潜力。

从富集结果分析可知, 淫羊藿主要从直接影响骨代谢和间接调节骨代谢两方面发挥抗骨质疏松的作用。①直接影响骨代谢。骨吸收和骨形成过程中的动态平衡异常是导致OP发生、发展过程中重要的发病机制, 而影响骨代谢的相关信号通路也是调控过程中主要的信号通路。上述结果显示, 主要富集在Wnt信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路和破骨细胞分化通路等。TGF-β能通过调节由间叶细胞衍生而来的前体细胞, 促进其分别向软骨细胞、成骨细胞分化, 抑制破骨细胞的活性^[12-13]。Notch在成骨细胞分化过程的早期阶段表达时, 通过诱导成骨细胞中骨保护素的表达, 抑制成骨细胞向成熟成骨细胞表型和成骨细胞功能发展, 从而抑制破骨细胞形成和骨吸收^[14]。MAPK对细胞的增殖、分化进行调控, 进而发挥相应的生物学作用, 在维持骨代谢平衡方面具有重要作用^[15]。上述结果提示, 淫羊藿抗OP的重要机制是调节OP发生、发展过程中骨代谢平衡异常的相关信号通路。②间接影响骨代谢。在明显富集的信号通路中仍存在部分调控其他系统的信号通路, 如PI3K-Akt信号通路、甲状腺素信号通路、心肌收缩信号通路、VEGF信号通路等。体内代谢之间是相互作用、相互联系的, 通过全身其他系统, 如循环系统、神经系统等多种代谢可以间接影响或干预骨微环境。

上述通路富集结果还显示, 网络集群中还覆盖了EB病毒感染、泛素介导的蛋白水解、酒精中毒、DNA复制、内质网中的蛋白加工等信号通路。故说明淫羊藿除直接作用于骨代谢相关信号通路, 还具有影响体内多种代谢途径的靶点以发挥抗OP作用的潜力。

通过上述通路网络图, 本研究发现, 上述通路在一定程度上与其他相关通路间存在多种多样的相互作用关系, 提示我们在治疗OP时应在针对局部关键通路的基础上, 仍应针对疾病病因、所处机体环境, 进行多靶点、多系统干预, 这也恰恰体现中医药治疗疾病的特点—治病求本、标本兼治, 也进一步说明中医多靶点、多方面进行综合干预的可行性和优势。

本研究利用网络药理学分析手段, 筛选了淫羊藿的入血成分, 并预测了其可能的直接作用靶点。进一步的蛋白质相互功能网络构建及分析, 确定了淫羊藿治疗OP的直接和间接调控靶点, 并以此为基础分析及可能的作用机制。从笔者分析的结果来看, 淫羊藿主要机制是促进成骨细胞增殖或抑制破骨细胞生成以及双向调节的活性成分, 发挥抗OP的作用。

基于网络药理学分析药物与疾病靶点的相互网络关系能有效地揭示淫羊藿治疗OP的疾病机制, 为后续机制进一步的探讨和实验设计的优化等提供了重要的基础, 使实验研究更加合理、更加具有指导性。同时, 本文也为相关机制的研究提供了思路和方法, 尤其是中药及其复方针对某种特定疾病的机制分析。