L-色氨酸是人体必需氨基酸，参与蛋白质以及一些重要生理物质代谢。最近研究发现，肿瘤细胞过度代谢色氨酸，其代谢产物犬尿氨酸可以促进肿瘤细胞生长迁移，并能抑制抗肿瘤免疫应答，且色氨酸代谢与肿瘤恶化程度及预后明显相关[1]。吲哚胺-2, 3-双加氧酶(indoleamine-2, 3-dioxygenase，IDO)是催化色氨酸生成犬尿氨酸的关键蛋白酶，且IDO对于免疫系统的调控也非常重要[2-4]。目前，已进入抗肿瘤临床试验阶段的IDO抑制剂主要包括INCB024360、NLG-919、1-MT等[5-7]。
槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物(结构式见Fig 1)，其药理作用广泛，对多种恶性肿瘤均有抑制其生长的作用[8-10]。据报道，槲皮素能够抑制LPS诱导的THP-1细胞中犬尿氨酸的产生，对IDO1有一定的抑制作用[11]。本研究从细胞水平、体外酶催化活性反应等多方面进一步确证了槲皮素对IDO1活性和色氨酸代谢的抑制作用，这可能是槲皮素抑制HeLa细胞增殖的机制之一。该研究为槲皮素抗肿瘤提供了又一理论依据，而且可以为指导临床妇科用药，特别是为更年期妇女保健及宫颈癌等肿瘤患者的用药提供参考。
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| Fig 1 Chemical structure of quercetin |
人宫颈癌HeLa细胞、人宫颈上皮永生化H8细胞均购自ATCC。
1.2 试剂DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；槲皮素、3-(N-吗啉基)丙磺酸[3-(N-morpholino) propanesulfonic acid，MOPS]、抗坏血酸、L-色氨酸、过氧化氢酶、亚甲基蓝、三氯乙酸、对二甲基氨基苯甲醛、L-犬尿氨酸、免疫印迹及其他所需试剂等，均购自Sigma-Aldrich；CCK-8试剂盒、细胞周期检测试剂盒，购自碧云天生物技术公司；人IFN-γ购自北京义翘神州生物技术有限公司；抗His抗体购自Cell Signaling Technology；引物由南京金斯瑞设计合成；RNA提取、反转录试剂盒(Promega)；SYBR Green mix(日本TOYOBO)。
1.3 仪器FACS CaliburTM流式细胞仪(Becton Dickinson公司)，高效液相色谱仪STI-501 plus(配备N2000色谱工作站，杭州赛智公司)，C1000实时荧光定量PCR系统、垂直板电泳仪(美国Bio-Rad公司)，Spectra Max 250酶标仪(美国Molecular Devices公司)，Flour Chem-FC2成像系统(美国Alpha Innotech)。
1.4 细胞培养HeLa细胞置于DMEM培养基(10%胎牛血清)中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。传代时，用PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化3 min，300×g离心5 min，更换新鲜的完全培养基。
1.5 CCK-8法检测细胞增殖HeLa细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的槲皮素，于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，设置未处理的正常对照组以及未加CCK-8的背景空白组，酶标仪450 nm处检测其吸光值(A)。用以下公式计算细胞相对存活率：细胞相对存活率=(A处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。
1.6 流式细胞术检测细胞周期5×105个HeLa细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养12 h，使细胞统一在G0期，再更换完全培养基，加入不同浓度的槲皮素，继续培养48 h。收细胞，加入预冷的体积分数为0.7的乙醇，置于冰箱4℃过夜，弃去乙醇，PBS洗2遍，加入碘化丙啶染液(0.03 g·L-1)、RNaseA(0.3 g·L-1)，37℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.7 qPCR检测IDO1基因的mRNA表达按照试剂盒说明书操作，提取HeLa细胞的总RNA，逆转录，然后用SYBR Green PCR Mix进行qPCR扩增反应。每组2个复孔，重复3次。结果以2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达倍数关系，GAPDH作为内参基因。本项实验中用到的引物序列如下：IDO1-F：5′-AGGGTTCTGGGAAGACCCAA-3′，IDO1-R：5′-ATGTCCTCCACCAGCAGTCT-3′；GAPDH-F：5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，GAPDH-R：5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。
1.8 HeLa细胞IDO的诱导表达及犬尿氨酸生成测定5×103个HeLa细胞接种于96孔培养板中，向培养基中加入人IFN-γ(终浓度为0.05 ng·L-1)和不同浓度的槲皮素，处理48 h后，取上清，加入三氯乙酸，50℃孵育30 min。离心去沉淀，加入质量体积比为0.02的对二甲氨基苯甲醛(溶剂为醋酸)并混匀，用酶标仪在480 nm波长处检测吸光度。
1.9 IDO1蛋白的表达、纯化及体外催化反应系统将pCMV3-C-His-IDO1质粒转染293T细胞，48 h后收细胞裂解蛋白，免疫印迹方法检测IDO1蛋白的表达情况，并用Ni柱纯化该蛋白，考马斯亮蓝染色法检测蛋白纯化的效率。IDO1蛋白体外酶活性反应实验的体系如下：2 mmol·L-1色氨酸，20 mmol·L-1抗坏血酸，3.5 μmol·L-1亚甲蓝，0.2 ng·L-1过氧化氢酶，10 μL IDO1蛋白裂解液，溶剂为50 mmol·L-1的MOPS缓冲液(pH 6.5)，37℃温箱中反应6 h。
1.10 高效液相色谱法(HPLC)检测色氨酸和犬尿氨酸含量的变化所用色谱柱是Hypersil Gold C8柱(5 μm，150 mm×4.6 mm，Thermo Fisher)。流动相是体积分数为0.09的乙腈，体积分数为0.001的乙酸和三氟乙酸。色谱柱的温度设定为25℃，流速为0.8 mL·min-1，使用紫外检测器，色氨酸的检测波长为280 nm，犬尿氨酸的检测波长为355 nm。
1.11 统计学分析统计学评估采用Student’s t test(两组比较)和One-way ANOVA(多组比较)。除非特殊说明，每个实验至少重复3次。数据用GraphPad Prism进行分析。
2 结果 2.1 槲皮素抑制HeLa细胞的增殖分别用不同浓度的槲皮素处理人宫颈癌HeLa细胞24 h。如Fig 2A所示，与对照组相比，槲皮素对HeLa细胞增殖具有明显的抑制作用，呈现剂量依赖效应；用10 μmol·L-1槲皮素处理HeLa细胞，随着时间的增长，其抑制效应也增强，48 h作用最明显(Fig 2B)。此外，用不同浓度的槲皮素处理HeLa细胞48 h，流式细胞仪检测槲皮素对细胞周期的影响，结果显示，与对照组相比，槲皮素作用于HeLa细胞48h后，可明显增加G0/G1期细胞的比例，抑制细胞增殖，并呈现出剂量依赖性(Fig 2C)。
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| Fig 2 Inhibition of cell proliferation and cell cycle progression by quercetin in HeLa cells A, B:Effect of quercetin on cell viability of HeLa cells; C:Quercetin induced cell cycle arrest in HeLa cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
HeLa细胞等肿瘤细胞在促炎因子(如IFN-γ)的诱导下，可表达大量内源性的IDO，因而在细胞培养上清中可检测到犬尿氨酸含量的变化。值得注意的是，在HeLa细胞中IFN-γ只能诱导IDO1的表达，而不能诱导IDO2或色氨酸-2, 3-双加氧酶(tryptophan 2, 3-dioxygenaes，TDO)的表达。在HeLa细胞中加入IFN-γ和不同浓度的槲皮素，48 h后收集细胞培养上清，经检测，槲皮素能够明显抑制IFN-γ诱导的犬尿氨酸生成(Fig 3)。
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| Fig 3 Effect of quercetin on kynurenine production Quercetin potently inhibited kynurenine production in IFN-γ treated HeLa cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs IFN-γ treatment group without quercetin |
为了验证槲皮素是否抑制人IDO1蛋白的酶活性，首先在293T细胞中表达了IDO1蛋白，用Ni柱纯化得到His-IDO1蛋白，并进行体外酶催化活性实验(Fig 4A、4B)。如Fig 4C、4D所示，加入IDO1蛋白的反应体系中犬尿氨酸(保留时间为6.8 min)的含量明显增加，底物色氨酸(保留时间为16.2 min)的含量相应减少，而加入1 μmol·L-1的槲皮素的样品中，犬尿氨酸的生成受到明显抑制，体系中还存在大量的底物色氨酸未发生反应，为排除蛋白和体系反应缓冲液的影响，我们对蛋白空白和体系空白也平行地进行了HPLC检测。该结果表明，槲皮素抑制IDO1的体外酶催化活性，导致色氨酸代谢受阻以及肿瘤细胞的增殖抑制。
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| Fig 4 Expression and catalytic activity of IDO1 in vitro A, B: The expression and purification of IDO1 protein; C: Determination of L-tryptophan and L-kynurenine by using HPLC after treatment with or without quercetin; D: Quantitative values from integrated peak area of HPLC. **P < 0.01 vs group treated without quercetin |
为了进一步确定槲皮素抑制HeLa细胞增殖与IDO1的酶催化活性有关，本研究检测槲皮素处理对IDO1表达的影响。如Fig 5所示，人宫颈癌HeLa细胞与正常人宫颈上皮永生化细胞相比，其IDO1的mRNA水平以及蛋白表达明显升高，这与已报道的结果相一致。多种肿瘤细胞高表达IDO1，从而异常代谢色氨酸，导致色氨酸的代谢产物犬尿氨酸大量堆积，从而促进肿瘤细胞的生成和迁移。另外，加入不同浓度的槲皮素(10、30 μmol·L-1)处理HeLa细胞24 h以后，其IDO1的转录水平和蛋白表达均无明显变化，证明槲皮素并不影响IDO1的表达。
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| Fig 5 Effect of quercetin on IDO1 mRNA level(A) and protein expression (B) in HeLa cells **P < 0.01 vs H8 cells group |
犬尿氨酸与肿瘤的发生与发展密切相关，为了进一步证明槲皮素抑制HeLa细胞的增殖与色氨酸代谢受阻有关，我们用槲皮素处理细胞的同时，外源性添加不同浓度的犬尿氨酸，观察细胞的增殖情况。如Fig 6所示，外源性添加犬尿氨酸能够明显逆转槲皮素引起的增殖抑制，一定程度上抵消了槲皮素的抗肿瘤作用。
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| Fig 6 Addition of kynurenine reverses inhibition of cell proliferation induced by quercetin *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs quercetin (10 μmol·L-1) treatment group without kynurenine addition; △P < 0.05 vs quercetin (30 μmol·L-1) treatment group without kynurenine addition |
色氨酸是人体必需氨基酸，色氨酸摄入不足或者代谢异常可导致疾病的发生。另据报道，色氨酸代谢在肿瘤细胞中异常活跃，这与肿瘤的免疫逃逸密切相关。色氨酸在肿瘤细胞中主要通过IDO进行代谢，IDO可催化色氨酸降解生成犬尿氨酸，犬尿氨酸可以与芳香族化合物受体AHR结合，激活AHR通路，从而促进肿瘤细胞生长和迁移。这也可能是槲皮素抑制HeLa细胞增殖的更深入的分子机制，我们还在做进一步的研究。
IDO在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色。IDO在人类不同肿瘤中的表达均有所升高，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌等，且IDO与肿瘤的预后也密切相关[12]。IDO不仅可催化色氨酸产生大量的犬尿氨酸，还可通过抑制抗肿瘤免疫反应，影响肿瘤的生长。临床试验证明，IDO的小分子抑制剂治疗能够恢复机体对肿瘤的排斥反应，而且可增强化疗药物的抗肿瘤效果。本研究表明，槲皮素对IDO的表达无影响，但具有明显抑制IDO酶活性的作用。
槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，许多中草药中都含有槲皮素，其具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保护心血管系统等[13-14]。槲皮素抗肿瘤机制复杂，如槲皮素可引起肿瘤细胞的凋亡、抑制血管生成、促进肿瘤细胞自噬等。本研究发现，槲皮素可能通过抑制IDO1的酶催化活性，从而影响细胞色氨酸的代谢，这也可能是槲皮素发挥抑制HeLa细胞增殖的作用机制之一。天然的小分子化合物是宝贵的资源，本文为槲皮素抗肿瘤提供了又一新的理论依据，同时也为免疫检查点IDO抑制剂的筛选开拓了新的思路。
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