2. 武汉大学 中南医院骨科，湖北 武汉 430071;
3. 武汉大学 发育源性疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071
2. Dept of Orthopedic Surgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China;
3. Hubei Provincial Key Lab of Developmentally Originated Disease, Wuhan 430071, China
流行病学资料显示，多种肾脏疾病(如高血压、慢性肾病等)均存在着宫内发育起源，不良宫内环境可致子代成年后相关疾病的易感性增加[1]。大量的动物实验和临床研究也证实，宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)可致胚胎肾脏发育不良，肾单位数量低于正常，出生后肾小球代偿性肥大和超滤过，并进一步导致肾小球硬化，出现高血压和肾损害的临床表现[2]。可见，胎肾发育不良是多种胎源性肾病的共同病理生理学基础。
IUGR的发生除了先天遗传因素外，很大程度上是因为孕中、晚期宫内环境欠佳所致，其中，孕期母体摄入咖啡因是确切的诱因之一。咖啡因存在于多种软饮料(如咖啡、可乐)中，并倍受人们喜爱，我国咖啡因的消耗量也在逐年增加。流行病学研究表明，孕妇每天咖啡因摄入量大于150 mg(2.5 mg·kg-1)就会导致IUGR，且摄入咖啡因的孕妇，其流产率可提高1倍多[3]。本课题组前期研究也证实，孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure, PCE)可导致胎鼠IUGR发生[4]。然而，PCE所致宫内胎肾发育不良的机制尚不明确。本研究首先在本室前期稳定建立的PCE所致大鼠IUGR模型上证实PCE胎鼠存在肾脏发育不良，进一步在细胞水平通过观察皮质酮(corticosterone, CORT)对后肾间充质细胞发育的影响以探究其发生机制，以期为证实孕期不良环境所致IUGR子代肾脏疾病易感性增加提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器咖啡因(分析纯级别)购自美国Sigma公司；乙醚购自上海恒远生物科技有限公司；大鼠CORT的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒购于美国R & D公司；A型胶原酶由瑞士Roche公司生产；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰酶均由美国Gibco公司生产；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；逆转录和实时荧光定量PCR试剂盒由大连TaKaRa公司提供。ND2000C紫外分光光度计和低温高速离心机均购于美国Thermo公司；显微镜购于日本Nikon公司；实时定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司。
1.2 实验动物及细胞处理SPF级健康♂[体质量(280±20)g]及♀[体质量(200±20)g]Wistar大鼠，由湖北省疾病预防控制中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2009-2011。适应性喂养1周后，每晚6时按♀ :♂=2 :1合笼，次晨观察雌鼠阴栓或阴道涂片镜检，查到阴栓或精子之日为受孕0 d(gestation day, GD0)。每日上午9时检查孕鼠生仔情况，若生仔记为生后d 0(PD0)。GD9-GD20每天经口灌胃给予不同剂量咖啡因(30、120 mg·kg-1)，对照组灌胃给予等容量蒸馏水，直至自然生产。在GD20，采用乙醚吸入的方式全身麻醉部分孕鼠，待翻正反射消失后迅速处死。将子代胎崽数为8~14个且♂♀比接近1的孕鼠纳入最终研究，收集它们各自的♀胎鼠。IUGR诊断依据为胎鼠体质量低于对照组胎鼠体质量平均值的2个标准差，IUGR率的计算是依据每窝IUGR胎鼠数比上该窝的总胎崽数。随机选择每一窝的♀胎鼠进行后续实验研究，收集大动脉血液，在4℃高速离心机下17 205×g离心15 min，留取上清液储存于-80 ℃冰箱，以测血CORT浓度，随机选取部分左侧胎肾固定于体积分数为0.04的中性甲醛固定液，待做形态学分析。右侧胎肾迅速用液氮冷冻，并储存于-80℃冰箱待进一步实验分析。
细胞实验：参照文献分离GD13.5原代后肾间充质细胞[5]，选择SPF级健康的孕13 d ♀ Wistar大鼠，由湖北省疾病预防控制中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。乙醚麻醉处死孕鼠，并经过体积分数为0.75的乙醇溶液进行灭菌，用无菌手术器械取出胚胎，并进入超净工作台中取出胎肾，置入加有PBS的培养皿中进行多次漂洗，用眼科剪剪碎胎肾，用0.2%的A型胶原酶消化约15 min得到原代后肾间充质细胞的悬液，经过细胞筛过滤后，离心机1 000×g离心5 min，洗涤细胞并去掉上清，得到原代后肾间充质细胞，按1×108·L-1的浓度接种在6孔板中，待细胞贴壁生长后，给予含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，并给予不同浓度CORT(250、500、1 000 μg·L-1)处理，24 h后收取细胞，运用实时定量PCR技术检测相关基因的表达变化。
1.3 血清CORT浓度的测定按照ELISA试剂盒说明书检测血清CORT浓度，其中试剂盒可检测到的最低CORT浓度为0.39 μg·L-1，其批间和批内变异系数分别为5.0%和7.2%。
1.4 病理学检查胎鼠实验中，每组随机选取3只胎鼠，取左侧肾脏，沿长轴纵向剖开，体积分数为0.04的中性甲醛固定液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色，在光学显微镜下观察肾脏形态学改变。对于每张切片，选取肾门正对区域，400倍光镜下拍照。
1.5 实时定量PCR检测按照RNA-Solv Reagent使用说明书提取胎肾和细胞总RNA。测定A260和A280，计算RNA的浓度及纯度，调整RNA浓度至1 g·L-1。cDNA合成和PCR扩增均按试剂盒说明进行。检测胎肾和细胞肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)组分中血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ receptor type 1, AT1R)、血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ receptor type 2, AT2R)、胶质源性神经营养因子(glial-cell-line-derived neurotrophic factor, GDNF)/c-Ret受体酪氨酸激酶(c-Ret tyrosine kinase receptor，c-Ret)通路、配对盒基因(paired box gene 2，Pax2)、Spry1以及内参基因GAPDH的mRNA表达。各指标引物及扩增条件见Tab 1。扩增产物回收按试剂盒说明进行。将回收产物以10倍梯度稀释成一系列浓度，根据预实验结果，选取至少5个梯度浓度为标准品，与样品一起在实时定量PCR仪(RG-3000 Rotor-Gene)上进行PCR扩增；以标准品的相对浓度为横坐标，测得各自的Ct值为纵坐标作图，即得标准曲线。根据样品Ct值在各自标准曲线上得到样品的相对浓度，以GAPDH作为内对照，计算各指标与GAPDH浓度比作为其mRNA表达的相对水平。每个样品针对GAPDH mRNA含量进行标准化。
| Gene | Forward primer(5′-3′) | Reverse primer(5′-3′) | Product/bp | Annealing |
| ACE | AGTGGGTGCTGCTCTTCCTA | ATGGGACACTCCTCTGTTGG | 188 | 60℃, 30 s |
| AT1R | CATCGTCCACCCAATGAAG | CGCGCACACTGTGATATT | 157 | 60℃, 30 s |
| AT2R | CTTCCATGTTCTGACCTTCTT | CGGTTTCCAACGAAACAATAC | 159 | 60℃, 30 s |
| GDNF | GATATTGTTAGCGGTTCCTGTG | AACCAGGCTGTCGTCTAA | 161 | 60℃, 30 s |
| c-Ret | GTTTCCCTGATGAGAAGAAGTG | GTGGACAGCAGGACAGATA | 130 | 60℃, 30 s |
| PI3K | GCGTGGCAACCTTTATCT | GCACACGTTCCCGTTTAT | 144 | 60℃, 30 s |
| Pax2 | CTTTGAGCGTCCTTCCTATC | GGTTGGTAGATGCAGATAGAC | 137 | 60℃, 30 s |
| Spry1 | CATCTACTCACTGCCTTGTC | AGGGTTGCCAACATCATC | 137 | 60℃, 30 s |
| GAPDH | GCAAGTTCAATGGCACAG | GCCAGTAGACTCCACGACA | 140 | 63℃, 30 s |
分别采用SPSS 18.0和Prism 5.0进行统计分析和图表制作。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行给药组与对照组间的比较。
2 结果 2.1 PCE对胎鼠肾脏形态与功能发育的影响首先，我们观察了宫内时期GD20 ♀胎鼠的肾脏发育。如Fig 1A所示，HE染色400倍光镜下可见，对照组胎肾生肾区肾小球结构正常，而PCE(120 mg·kg-1)组胎肾肾小球球囊空虚，鲍曼囊腔变大，肾小球毛细血管网发育不良。Fig 1B-1E的qPCR结果显示，与对照组相比，PCE(30、120 mg·kg-1)组胎肾发育基因Pax2、GDNF、c-Ret、PI3K的mRNA表达均呈剂量依赖性降低(P < 0.05，P < 0.01)。提示PCE可导致胎肾发育不良，与胎肾GDNF/c-Ret信号通路低表达有关。
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| Fig 1 Effects of prenatal caffeine exposure (PCE) on fetal kidney development and GDNF/c-Ret pathway-related genes in female fetal rats(x±s, n=5~7) A: Kidney sections were stained with HE (×400); B: Pax2 mRNA expression; C: GDNF mRNA expression; D: c-Ret mRNA expression; E: PI3K mRNA expression. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
为了探讨血CORT和肾脏组织RAS是否参与PCE所致的胎肾发育不良，我们检测了胎血CORT浓度、胎肾局部RAS组分(ACE、AT1R、AT2R)的表达。如Fig 2A所示，与对照组相比，PCE (30 mg·kg-1)组的胎血CORT浓度无明显变化，而PCE(120 mg·kg-1)组升高(P < 0.05)。Fig 2B~2D的qPCR结果显示，与对照组相比，PCE(30、120 mg·kg-1)组胎肾ACE、AT1R、AT2R的mRNA表达均呈剂量依赖性降低(P < 0.05, P < 0.01)。提示PCE可升高胎血CORT含量，并使胎肾AT1R、AT2R的表达抑制。
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| Fig 2 Effects of PCE on serum corticosterone (CORT) concentration and renal renin-angiotensin system-related genes in female fetal rats(x±s, n=5~8) A: Serum CORT concentration; B: ACE mRNA expression; C: AT1R mRNA expression; D: AT2R mRNA expression. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
为了探究PCE所致胎肾发育不良的具体机制，我们在细胞水平观察了CORT对原代后肾间充质细胞相关基因的表达影响。基于Fig 2A中的血清CORT浓度，我们细胞实验中选择的浓度分别为250、500、1 000 μg·L-1。如Fig 3所示，与对照组相比，CORT(250、500、1 000 μg·L-1)处理细胞24 h，GDNF/c-Ret信号通路Pax2、GDNF、c-Ret表达呈不同程度的降低(P < 0.05，P < 0.01)。而与对照组相比，CORT(250、500、1 000 μg·L-1)处理细胞24 h，GDNF/c-Ret信号通路抑制基因Spry1的表达呈不同程度的升高(P < 0.01)。提示CORT可使原代后肾间充质细胞的GDNF/c-Ret信号通路的表达抑制。
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| Fig 3 Effects of CORT on GDNF/c-Ret pathway-related genes in metanephric mesenchyme stem cells(x±s, n=5) A: Pax2 mRNA expression; B: GDNF mRNA expression; C: c-Ret mRNA expression; D: Spry1 mRNA expression. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
我们进一步检测CORT对原代后肾间充质细胞RAS组分的影响。如Fig 4所示，与对照组相比，CORT(250、500、1 000 μg·L-1)处理细胞24 h后，RAS组分(ACE、AT1R、AT2R)表达呈不同程度的降低(P < 0.05, P < 0.01)。提示CORT可使原代后肾间充质细胞的AT1R、AT2R的表达抑制。
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| Fig 4 Effects of CORT on renin-angiotensin system-related genes in metanephric mesenchyme stem cells(x±s, n=5) A: ACE mRNA expression; B: AT1R mRNA expression; C: AT2R mRNA expression. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
本室前期研究发现，孕期尼古丁暴露可导致IUGR胎鼠肾脏发育不良，且成年后肾小球硬化的易感性增加[6]。因此，为了研究PCE所致IUGR仔鼠胎肾发育不良的机制，我们首先观察了胎肾发育的变化。病理学检查发现，PCE(120 mg·kg-1)组胎肾肾小球囊腔间隙加大，肾小球毛细血管网发育不良。提示PCE可导致胎肾发育不良，这可能是成年后肾小球硬化的宫内发育起源。
已知GDNF/c-Ret信号通路是后肾发育的主要诱导者。后肾间充质细胞分泌GDNF，该因子与肾导管上皮细胞中表达的c-Ret酪氨酸激酶受体和GFRα1受体结合，激活PI3K/Akt、MAPK、PLCγ等下游信号通路，诱导输尿管芽的分支[7]。同时，GDNF/ c-Ret信号通路还受到多种上游信号分子的调节，其中，Spry1能抑制该信号通路的活性，而Pax2能激活GDNF信号通路[8]。本研究中，PCE(30、120 mg·kg-1)组胎肾Pax2、GDNF、c-Ret、PI3K的mRNA表达水平均降低，提示PCE可抑制Pax2/GDNF/ c-Ret/PI3K信号通路，可能是其抑制胎肾发育的机制之一。文献证实，肾单位的减少与肾内RAS组分表达的改变有关[9]。在胎儿发育过程中，RAS的主要活性物质Ang Ⅱ能在肾脏局部表达[10]。其生理作用的发挥主要是通过其受体实现的，Ang Ⅱ与AT1R结合后，可活化EGF、RTK、c-Ret等RTK蛋白，继而激活GDNF/c-Ret通路下游PI3K通路；而与AT2R的结合可促进GDNF/c-Ret通路上游基因Pax2的表达，从而激活GDNF/c-Ret通路[11]。可见，AT1R和AT2R对胎肾发育均有促进作用，但作用环节不同。在本研究中，我们发现PCE(30、120 mg·kg-1)组♀胎肾AT1R和AT2R的mRNA表达水平降低。这些结果提示，PCE可能通过抑制♀胎鼠肾脏局部ATRs及GDNF/c-Ret信号通路相关基因的表达，从而抑制肾单位的发育，造成胎肾发育不良。
本实验室前期研究发现，PCE可引起子代IUGR及多脏器发育不良，其发生与PCE所致胎盘糖皮质激素(glucocorticoid, GC)屏障开放，导致母源性GC过暴露有关[12]。文献报道，宫内时期高GC水平是胎儿疾病编程的主要始动因素，高GC通过调控胎儿一系列神经内分泌代谢过程，引起胚胎组织结构和功能的持续性改变[13-14]。本研究中，PCE(120 mg·kg-1)组♀胎鼠血CORT浓度也明显升高；另有研究则认为，GC过暴露可以负向调节胎儿肾内RAS组分的表达[15]。提示PCE胎鼠肾脏局部ATR的低表达可能与宫内高CORT有关。因此，为了探究其具体机制，我们进一步使用外源性CORT处理原代后肾间充质细胞。结果发现，不同浓度外源性CORT处理可使后肾间充质细胞AT1R、AT2R、Pax2、GDNF、c-Ret的mRNA表达水平均降低，而Spry1表达则有不同程度升高。综合上述，我们证实，高CORT可通过抑制肾脏组织中AT1R/AT2R及GDNF/c-Ret信号通路的表达，进而导致胎肾发育不良。
综上，我们在证实PCE所致胎肾发育不良的基础上，提出了高血CORT可能介导PCE所致♀子代胎肾发育不良的机制。我们认为，PCE所致高血CORT可抑制胎肾AT1R/AT2R及GDNF/c-Ret信号通路的表达，导致胎肾发育不良。本研究结果为了解PCE的肾脏发育毒性并阐明其毒性机制，提供了实验和理论依据。
( 致谢: 本实验主要在武汉大学基础医学院药理学系汪晖实验室完成，感谢李宁、钟卫华饲养动物。)
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