2. 广州中医药大学第一附属医院耳鼻咽喉科，广东 广州 510405;
3. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405
2. Dept of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China;
3. the First School of Clinical Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
过敏性哮喘是由嗜酸粒细胞、淋巴细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症疾病，常表现为以支气管平滑肌收缩为主的过敏反应性症状及Th2型炎症反应[1]。现认为胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是Th2型炎症反应的重要启动因素[2]。过敏原或炎症因子刺激上皮细胞产生TSLP[3]。TSLP因子可以通过促进树突状细胞成熟、诱导Th2型细胞增加及相应的炎症因子释放，最终导致嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润，加重哮喘的炎症反应[4]。
儿茶素是茶多酚中的主要活性成分，已有报道发现其可缓解过敏性角膜炎豚鼠的过敏症状[5]，且有一定的体外抗炎作用[6]，但其对过敏性哮喘是否有治疗作用尚不明确。故本研究对儿茶素对卵清蛋白(ovalbumin, OVA)所致过敏性哮喘小鼠的治疗作用及其机制进行了初步探讨。
1 材料 1.1 试剂儿茶素标准品、OVA(美国Sigma公司)；氯雷他定片(批号：SH00064，拜耳医药上海有限公司)；氢氧化铝凝胶、DAPI(美国Thermo公司)；小鼠OVA特异性IgE ELISA试剂盒(美国Biolegend公司)；小鼠IL-5、小鼠IL-13 ELISA试剂盒(台湾Arigo公司)；兔抗小鼠p65抗体、兔抗小鼠IκB抗体(美国Cell Signal公司)；抗β-actin抗体(博士德公司)；细胞核蛋白与胞质蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术公司)；山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG) (H+L)-HRP、山羊抗兔IgG(H+L)-HRP(三箭生物技术公司)；DyLight 549-羊抗兔IgG (H+L)(联科生物公司)。
1.2 仪器ECLIPSE TE2000-S型倒置显微镜(日本Nikon公司)；Mini-PROTEAN Tetra Cell型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanno5200型全自动化学发光图像分析仪(Tanno公司)；D3024R型微型高速冷冻离心机(赛洛捷克公司)；LSM800激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss公司)。
2 方法 2.1 过敏性哮喘小鼠模型的制备SPF级8周龄BALB/c ♀小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心(合格证号：44005800005107)。分为正常组、模型组、儿茶素给药组(75、150、300 mg·kg-1)、氯雷他定组(2 mg·kg-1)，每组6只。模型组与各给药组于d 1、8、15腹腔注射25 μg OVA、1 mg氢氧化铝完成基础致敏，并在d 22~28，鼻部给予1 mg OVA激发[7]，正常组以相应体积的PBS代替。在激发前30 min, 给药组灌胃给予相应的药物(Fig 1)。
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| Fig 1 Allergic asthma model On day 1, 8 and 15, mice received an intraperitoneal injection of 25 μg of ovalbumin (OVA) and 1 mg of alum in 300 μL of phosphate-buffered saline. One week after the last OVA sensitization (day 21), a series of seven daily intranasal OVA(500 μg) challenges were administered. |
取小鼠外周血于无菌EP管中，3 000 r·min-1，4℃离心10 min，得小鼠血清。配制标准曲线，加样孵育洗涤后，加入酶标抗体孵育洗涤，加底物液显色，终止反应后，450 nm、570 nm检测吸光度。
2.3 血液分析仪分析小鼠外周血细胞的比例取50 μL小鼠外周血于无菌EP管中，加入5 μL肝素钠混匀后，于兽用血液分析仪分析小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞的比例。
2.4 肺组织病理切片完成最后一次激发后24 h，脱颈椎处死小鼠，取出新鲜的组织，固定于4%多聚甲醛中。组织经乙醇脱水、二甲苯透化后，石蜡包埋切片。切片用苏木精、伊红染色后，再次脱水透明，最后用中性树胶封片。
2.5 ELISA法检测肺组织中TSLP、IL-5、IL-13的含量取30 mg左右新鲜组织，加入300 μL生理盐水低温匀浆1 min，4℃、5 000 r·min-1离心5 min，2次离心后，取上清得匀浆液，并用BCA试剂盒检测其浓度。配制标准曲线，加样孵育洗涤后，加入酶标抗体孵育洗涤，加底物液显色，终止反应后，450 nm检测吸光度。
2.6 蛋白印迹法检测肺组织中NF-κB p65、IκB蛋白的表达情况取30 mg新鲜组织，加入200 μL含1% PMSF的胞质蛋白提取剂，低温匀浆1 min，冰浴15 min，4℃、15 000×g离心5 min后，取上清得胞质蛋白。PBS冲洗后，加入50 μL含1% PMSF的核蛋白提取剂，每1 min涡旋1次，涡旋10次，4℃、15 000×g离心5 min后，取上清得核蛋白。提取的蛋白用BCA试剂盒检测其浓度，蛋白变性，以20 μg蛋白量计算上样体积。电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，5% TBST清洗；加入一抗，4℃孵育过夜。5% TBST室温清洗；加入二抗，室温孵育1 h，5% TBST清洗二抗；ECL液显色4 min后，拍照，图像分析系统计算各泳道灰度值。
2.7 免疫荧光检测肺组织中NF-κB p65蛋白核转录情况取肺组织石蜡切片，60 ℃烘烤后，松节油、乙醇梯度脱蜡，枸橼酸抗原修复。0.2% Triton X-100透化，10%山羊血清封闭，加入NF-κB p65抗体4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗，DAPI封片，激光共聚焦显微镜观察。
2.8 数据处理所有数据以x±s表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。所有统计学分析均采用SPSS 15.0统计软件处理。
3 结果 3.1 儿茶素对过敏性哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE的影响如Fig 2所示，给予儿茶素干预后，小鼠血清的OVA特异性IgE含量明显减少(P < 0.05)。
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| Fig 2 Level of OVA-specific IgE in serum of allergic asthma mice *P < 0.05 vs model |
如Fig 3所示，给予儿茶素干预后，哮喘小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞及单核细胞明显减少(P < 0.05)。
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| Fig 3 Proportion of inflammatory cells in peripheral blood of allergic asthma mice A: WBC; B: Gran; C: Lymphocyte; D: Monocyte. #P < 0.05 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
Fig 4的HE染色结果表明，哮喘小鼠肺组织中炎症细胞浸润明显，给予儿茶素后可明显缓解这种症状。
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| Fig 4 Results of HE staining in lung(×200) A: Control; B: Model; C: Catechin 75 mg·kg-1; D: Catechin 150 mg·kg-1; E: Catechin 300 mg·kg-1; F: Loratadine 2 mg·kg-1 |
ELISA法检测肺组织中TSLP及Th2炎症因子的含量，如Fig 5所示，儿茶素可抑制肺组织中TSLP、IL-5、IL-13的上升(P < 0.05或P < 0.01)。
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| Fig 5 Levels of TSLP (A), IL-5(B), IL-13(C) in lung tissues of allergic asthma mice #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
Fig 6 Western blot结果表明，儿茶素可抑制NF-κB p65入核转录，并增加其调节因子IκB的表达。
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| Fig 6 Expression of NF-κB p65, IκB in mouse lung tissues by Western blot A: NF-κB p65 and IκB in cytoplasm; B: NF-κB p65 in nucleus. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
Fig 7结果表明，儿茶素可明显抑制NF-κB p65核转录，核内NF-κB p65的表达减弱。
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| Fig 7 Nuclear transcription of NF-κB p65 in immunofluorescence |
过敏性哮喘是一种常见的、以气道炎症为主要特征的慢性呼吸系统疾病。过敏性哮喘发病机制受过敏原、基因遗传等因素的影响，临床上常表现为不同淋巴细胞亚群的失平衡、嗜酸性粒细胞的气道浸润、Th2细胞因子过度表达等。
2型辅助性T细胞(Th2细胞)在过敏性鼻炎、过敏性哮喘等过敏反应中起关键作用[8]，其分泌的Th2因子如IL-4、IL-5、IL-13，可促使嗜酸性粒细胞迁移至炎症部位，并可诱导B细胞释放IgE抗体。研究发现，TSLP是Th2型炎症反应的重要启动因素。尘螨等过敏原可刺激上皮细胞分泌TSLP因子，来源于上皮的TSLP可通过促进树突状细胞OX40L与CD4+T细胞上的OX40结合, 进而使CD4+T细胞向Th2亚群分化，上调Th2细胞因子的比例[9]。与此同时，Th2细胞因子IL-13又可刺激上皮细胞分泌TSLP，最终导致呼吸道炎症的反复与难愈。
本研究通过ELISA法检测肺部匀浆液中TSLP的含量，发现儿茶素可抑制TSLP的表达，且给药组与模型组之间差异具有统计学意义；在给予儿茶素干预之后，肺组织中IL-5和IL-13的含量同样明显降低。此外，儿茶素可以降低OVA所致的过敏性哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE的含量及小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞、单核细胞的比例，且在高剂量组中，这种差异具有统计学意义。通过HE染色观察肺组织局部病变，发现儿茶素同样可以缓解肺组织中炎症反应，明显减轻炎症细胞的浸润情况，提示儿茶素可能通过抑制TSLP的表达，缓解下游的炎症反应。
目前认为，在过敏性炎症中，细胞因子、微生物、环境过敏原等多种因素可刺激TSLP表达，而NF-κB信号通路可能是TSLP表达的重要调控机制[10]。研究发现，TNF-α、IL-1β可通过刺激NF-κB信号通路，诱导气道上皮细胞及角质细胞分泌TSLP因子[11-12]；IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β, IKKβ)缺失或NF-κB信号抑制剂干预，则减少上皮细胞表达TSLP[13]。亦有研究指出，儿茶素类化合物可通过抑制NF-κB信号通路，缓解大鼠的肝损伤[14]。故本研究考察了儿茶素对NF-κB信号通路活化的经典途径(IκBα降解、NF-κB p65入核)的干预作用[15]。结果发现，儿茶素可抑制NF-κB p65进入细胞核，并上调IκB水平，减轻炎症反应，有效地抑制NF-κB信号的活化。
综上所述，儿茶素可有效地缓解OVA所致的过敏性哮喘小鼠的Th2炎症反应及其过敏症状，其作用可能是通过调控NF-κB通路，减少TSLP的表达而实现的。
( 致谢: 本实验主要在广州中医药大学中药学院中医药免疫室完成，非常感谢本课题组的全体老师及同学对实验的指导和帮助。)
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