2. 山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009
2. Insitute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong Shanxi 037009, China
小胶质细胞(microglia, MG)分布于整个中枢神经系统，属于单核吞噬细胞，是中枢神经系统最主要的免疫防线。正常情况下，激活的MG不停地清除有毒物质、损坏的神经、折叠错误的蛋白等[1]。在病理情况下，MG持续激活，释放大量细胞毒性因子，且细胞表面膜受体密度急剧增加，如甲酰肽受体-2(formyl peptide receptor-2, FPR2)、糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)、CD36等[2-3]。这些受体在周围刺激因子的作用下，引起炎症的级联反应，促进了神经炎症的循环恶化，加重正常神经组织和细胞损伤。
FPR属于趋化受体家族，主要有FPR1、FPR2、FPR3 3种亚型，是7次跨膜的G蛋白偶联受体，可以介导免疫调节、炎症因子分泌、细胞趋化和细胞黏附，与多种疾病的发生发展密切相关。FPR2含有351个氨基酸残基，与FPR1和FPR3的同源性高达69%和83%[4]。FPR1和FPR2是研究最为广泛的受体，它们主要分布于肥大细胞、粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞，此外还表达于肺上皮细胞、肝细胞、肾细胞、血管内皮细胞和星形胶质细胞[5]。因此，FPR1和FPR2与很多疾病密切相关，包括细菌和病毒感染、炎症、肿瘤、神经退行性疾病和代谢性相关疾病等，使得它们成为治疗多种疾病潜在的靶点。但FPR1和FPR2与MG介导的炎症之间的关系并不清楚，因此，本研究用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的MG系BV-2细胞为炎症模型，初步探讨其在LPS诱导的中枢神经炎症中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株小胶质细胞系BV-2细胞，购自武汉大学细胞库。
1.1.2 试剂DMEM高糖培养基(Gibco公司)；LPS、甲酰化肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalainie, fMLF)、Boc-2细胞裂解液，均购自Sigma公司；Leu-Glu-Ser-Ile-Phe-Arg-Ser-Leu-Leu-Phe-Arg-Val-Met(MMK-1)(Tocris Bioscience公司)；DAPI(碧云天生物技术公司)；ECL(Thermo公司)；小鼠β-actin抗体、小鼠NF-κB抗体、小鼠磷酸化NF-κB抗体(Bioworld公司)；小鼠FPR2抗体(Santa Cruz公司)；小鼠FPR1抗体(Abcam公司)；白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α) ELISA试剂盒(R & D公司)；辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(康为世纪)。
1.1.3 仪器CO2培养箱(Thermo)，全波长酶标仪(Molecular Devices)，小型垂直电泳槽、小型湿法转膜仪、基础通用电源(Bio-Rad)。
1.2 方法 1.2.1 Western blot实验BV-2细胞接种于60 mm培养皿，用1 mg·L-1的LPS孵育12 h后，收集细胞，用lysis裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白上样量为30 μg，10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜(200 mA, 2 h)，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，室温孵育二抗2 h，ECL法检测。
1.2.2 Transwell趋化实验取对数生长期的BV-2细胞悬液，接种于100 mm培养皿，LPS作用12 h后，细胞用无血清的高糖DMEM重悬，将细胞数调整为5×108·L-1。①考察FPR2在BV-2细胞趋化中的作用。分别取上述200 μL细胞置于Transwell小室上室。下室分别以高糖DMEM、fMLF(2、5、10、20、50、100 nmol·L-1)和MMK-1(2、5、10、20、50 nmol·L-1)为趋化剂。②验证FPR2介导的细胞趋化可被其特异性的拮抗剂Boc-2阻断。上述细胞分为Boc-2+MMK-1组和MMK-1组。Boc-2+MMK-1组：预先用含10 μmol·L-1的Boc-2培养液孵育30 min，PBS洗3遍后，无血清的高糖DMEM重悬，细胞数调整为5×108·L-1，取200 μL细胞置于Transwell小室上室。MMK-1组：预先用无血清的高糖DMEM孵育细胞30 min，PBS洗3遍后，无血清的高糖DMEM重悬，细胞数调整为5×108·L-1，取200 μL细胞置于Transwell小室上室。在CO2培养箱继续培养24 h，去除培养液，用PBS洗3次，甲醇固定10 min，5 mg·L-1的DAPI室温孵育20 min后，PBS洗3次，荧光显微镜下观察拍照。实验结果用趋化指数表示，趋化指数为给药组与空白组的比值[6]。
1.2.3 ELISA法检测IL-1β和TNF-α水平取对数生长期的BV-2细胞悬液，调整细胞密度为5×108·L-1，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，培养24 h后，加入1 mg·L-1的LPS孵育12 h，建立体外细胞炎症模型。①检测FPR2对BV-2细胞炎性因子分泌的影响。上述细胞分别加入完全培养液，fMLF(20 nmol·L-1)和MMK-1(20 nmol·L-1)，每组6个复孔。②考察FPR2介导的细胞炎性因子可被其特异性的拮抗剂Boc-2阻断。上述细胞分为Boc-2+MMK-1组和MMK-1组。Boc-2+MMK-1组：预先用10 μmol·L-1的Boc-2培养液孵育细胞30 min，PBS洗3遍后，加入20 nmol·L-1的MMK-1，6个复孔；MMK-1组：预先用完全培养液孵育细胞30 min，PBS洗3遍后，加入20 nmol·L-1的MMK-1，6个复孔。在CO2培养箱继续培养24 h，用ELISA法检测TNF-α和IL-1β的分泌情况。
1.2.4 统计学方法应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，数据用x±s表示。单因素方差分析(One-Way ANOVA)后，用Dunnett’s test分析方法比较组间差异。两组间比较采用T-test法[7]。
2 结果 2.1 LPS对BV-2细胞表面FPR2表达的影响LPS孵育BV-2细胞12 h后发现FPR1蛋白没有明显变化，而FPR2表达明显上调(Fig 1)，表明LPS可诱导BV-2细胞FPR2表达增加，而不是FPR1。
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| Fig 1 Levels of FPR1 and FPR2 in LPS-induced-BV-2 cells A: LPS up-regulated expression of FPR2; B: The relative grey value of FPR1 and FPR2 protein. **P < 0.01 vs control |
fMLF和MMK-1分别是FPR1和FPR2特异性激动剂，本研究考察了不同浓度的fMLF和MMK-1对LPS-BV-2细胞的趋化作用。Fig 2结果表明，20 nmol·L-1的MMK-1可明显诱导LPS-BV-2细胞趋化，而fMLF却没有此效应。说明FPR2参与了LPS诱导的炎症反应。
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| Fig 2 Chemotaxis of LPS-BV-2 cells induced by fMLF and MMK-1 The chemotaxis of LPS-BV-2 cells induced by different doses of MMK-1(A) and fMLF(C); B, D: The quantitative analysis of cell migration induced by MMK-1 and fMLF. *P < 0.05 vs LPS. |
为了验证FPR2的作用，本研究检测了fMLF和MMK-1对LPS-BV-2细胞炎症因子释放的影响。Fig 3结果表明，与LPS组相比，MMK-1可以进一步促进IL-1β和TNF-α的分泌。
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| Fig 3 Effect of fMLF and MMK-1 on LPS-BV-2-cells A: Enhancement of IL-1β induced by fMLF and MMK-1; B: Enhancement of TNF-α induced by fMLF and MMK-1. *P < 0.05 vs LPS. |
为了进一步验证FPR2对炎症的促进作用，我们考察了FPR2的拮抗剂Boc-2对MMK-1效应的作用，发现10 μmol·L-1的Boc-2可以抑制MMK-1诱导的细胞趋化和炎症因子的释放(Fig 4)。
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| Fig 4 Effect of Boc-2 on MMK-1-induced LPS-BV-2-cells The inhibitory effect of 10 μmol·L-1 Boc-2 on chemotaxis of cells induced by MMK-1; B: The quantitative analysis of cell migration inhibited by Boc-2; C, D: The inhibitory effect of 10 μmol·L-1 Boc-2 on secretion of IL-1β and TNF-α. **P < 0.01 vs MMK-1. |
NF-κB是一类重要的核转录因子，与细胞迁移、炎症因子分泌等密切相关[8]，因此，我们考察了MMK-1和抑制剂Boc-2对NF-κB的影响。结果发现，Boc-2可以抑制MMK-1引起的NF-κB的磷酸化(Fig 5)，表明NF-κB参与了FPR2介导的细胞行为。
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| Fig 5 The inhibitory effect of 10 μmol·L-1 Boc-2 on p-NF-κB of LPS-BV-2 cells induced by MMK-1 *P < 0.05 vs MMK-1 |
近年来，MG介导的神经炎症在神经退行性疾病中的重要作用，使其成为研究热点，专家学者们都致力于阐明何种因子在其中为关键因素，进而找到有效的治疗靶点。由于FPR家族在炎症中的重要作用，使其不可避免地牵涉到神经炎症中。而且，FPR2能介导Aβ42引起的炎症反应，在阿尔茨海默病脑部炎症中起重要作用[4]。但异常活化的MG中FPR2是否参与炎症的持续恶化，并不清楚。在此基础之上，本文研究了LPS激活的BV-2细胞炎性反应中FPR1和FPR2的作用，发现LPS-BV-2细胞中FPR1表达没有变化，而FPR2蛋白表达上调，说明LPS刺激MG引发的神经炎症没有FPR1的参与，但可能与FPR2相关。
FPR2重要的激动剂有20多种，分别有病原微生物、内源性肽类或脂类和肽库或化合物来源，由于其基因的多态性，与不同的配体结合会产生不同的生理效应[9]。MMK-1是肽库中筛选得到的激动剂，可通过FPR2趋化细胞、引起钙动员、激活NADPH氧化酶和炎症因子的分泌[10-11]。fMLF主要激动FPR1，可募集免疫细胞，促进黏附和炎症反应[12]。Boc-FLFLFL(Boc-2)是FPR2的拮抗剂，能消除其激动剂脂氧素A4引起的细胞生物学效应[13]。为了验证FPR2的重要作用，我们检测了FPR1的激动剂fMLF、FPR2的激动剂MMK-1和拮抗剂Boc-2对LPS-BV-2细胞功能的影响，发现MMK-1可促进细胞迁移、增加IL-1β和TNF-α分泌、引起NF-κB磷酸化，这些效应均可被Boc-2拮抗。另外，fMLF对LPS-BV-2细胞功能并没有明显影响。确证了FPR2被活化后，可激活相关的信号通路，募集炎症细胞，释放炎症因子，从而放大中枢神经炎症，促进疾病的发生发展。
综上所述，本研究初步发现，LPS刺激BV-2细胞可以上调FPR2蛋白表达，且FPR2参与了之后的炎症级联反应，为神经炎症的缓解和治疗提供了新靶点。但其在神经炎症中的权重尚不清楚，这将是我们下一步研究的重点内容。
( 致谢: 本研究是在国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室完成的，感谢研究室各位老师的无私帮助。)
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