焦虑性抑郁症是一种重性抑郁与焦虑共病的复合型精神障碍疾病，具有精神运动迟滞、致残率及自杀率高、社会功能损害重、预后差等特征[1]。大量研究表明，焦虑与抑郁的发病机制均涉及到神经递质失调[2]、下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrena，HPA)轴紊乱、神经营养缺乏等[3]，然而，焦虑性抑郁疾病的发病机制研究进展缓慢。本课题组前期已建立焦虑性抑郁大鼠模型[4]，但考虑到该复合型疾病的特殊性以及啮齿类动物与人类亲缘关系的疏远性，采用常规的啮齿类动物并不能完全满足该疾病的研究，建立一种更能模拟焦虑性抑郁临床发病特点的合适模型对该病的防治尤为重要[5]。
因此，本实验拟采用近灵长类动物树鼩[6]为研究对象，通过慢性皮质酮注射建立焦虑性抑郁树鼩模型，研究焦虑性抑郁模型树鼩血浆促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、皮质醇(cortisol，COR)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)及海马、杏仁核、前额叶皮质的单胺递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)含量的表达情况，并采用临床治疗该疾病的一线用药文拉法辛对模型树鼩进行干预，进行药物预见性研究，确定模型的可行性，为该病的临床防治及抗焦虑性抑郁新药的研发提供有力的实验基础。
1 材料与方法 1.1 动物CL级中缅树鼩12只，♂，体质量130~150 g，购自云南昆明树鼩种质资源中心，饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心[SYXK(湘)2015-0003]。饲养于不锈钢笼具内，室温(24±2)℃、相对湿度(50±5) %、光/暗周期12 h/12 h，按实验动物3R原则给予人道关怀。
1.2 试剂与仪器CRH、ACTH、CORT试剂盒(美国R&D公司)；文拉法辛缓释片(成都康弘药业)；皮质酮(北京索莱宝生物公司)；5-HT、NE、DA对照品(中国药品生物制品检定所)。Morris水迷宫(北京智鼠多宝生物科技公司)；动物行为学习记忆系统(法国Viewpoint公司)；MK-3型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；全自动匀浆机(德国IKA公司)；1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；SDC电化学检测器(荷兰Antec公司)。
1.3 造模及分组12只树鼩随机分为3组：正常组、模型组、文拉法辛组，每组4只。正常组树鼩正常饲养；根据文献报道的树鼩对大鼠体表换算系数[7]，模型组树鼩每天给予皮质酮皮下注射(27 mg·kg-1)，持续21 d；文拉法辛组树鼩于造模同时灌胃给予药物文拉法辛(6 mg·kg-1，21 d)，正常组和模型组给予等体积生理盐水，造模完成后，进行行为学测试。测试完成后，将动物麻醉，腹主动脉取血，于冷冻台上分离出大脑海马、杏仁核、前额叶皮质、丘脑等组织，液氮中保存备用。
1.4 行为学检测 1.4.1 自主活动评分造模结束后，分析树鼩的自主活动能力，时间为5 min。自主活动评分包括移动(水平方向的位移)和跳跃(垂直方向的位移)，将两者次数相加表示各组树鼩的相对活动能力。
1.4.2 糖水偏好测试各组树鼩禁水12 h后，每笼放置2个水盒，一个装100 mL蔗糖水(0.029 mol·L-1)，另一个装等量的蒸馏水，测定树鼩在6 h(9：00~15：00)内分别摄入蔗糖水和蒸馏水的体积，并计算糖水偏好率(糖水消耗体积/总消耗体积×100%)。
1.4.3 Morris水迷宫实验水槽平均划分为A、B、C、D 4个象限，用奶粉将水调成乳白色，将平台置于水面下2 cm，使其在实验光线下对树鼩不可见。于实验d 17开始对树鼩进行适应性训练，即从平台象限的正对面将树鼩面向池壁放入水中，若75 s内未找到平台，则将其牵引至平台处停留10 s，每天训练1次，持续4 d[8]。每次训练结束后，迅速用毛巾将树鼩毛发擦干，以防止树鼩低体温。
定位航行实验：训练完成后，将树鼩从训练位置面向池壁放入水中，观察并记录树鼩爬上平台所需时间，即逃避潜伏期(escape latency，EL)，考察其学习能力。
探索实验：于实验d 21撤除平台，由同一入水点将树鼩面向池壁放入水中，记录1 min内树鼩在平台所在象限的停留时间(stay time，ST)，考察其记忆能力。
1.5 HPA轴指标含量测定行为学测试完成后，用戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)将动物麻醉，腹主动脉取血，收集于肝素钠管中，3 000 r·min-1离心15 min，取血浆，-80℃保存。严格按照ELISA试剂盒说明书检测各组树鼩血浆CRH、ACTH、COR的含量。
1.6 单胺递质含量测定 1.6.1 脑组织匀浆样本制备取冷冻保存的海马、杏仁核、前额叶皮质，精密称重，按1：3比例(杏仁核为1：10)分别加入0.01 mol·L-1高氯酸溶液(内含0.03 mmol·L-1 EDTA，10 μg·L-1内标DHBA)，于冰上进行匀浆，匀浆后4℃、13 000 r·min-1离心10 min，取上清，用0.22 μm针头过滤器过滤后进样。
1.6.2 色谱条件色谱柱：Quattro 3 C18柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm)；流动相：含90 mmol·L-1单水磷酸二氢钠、50 mmol·L-1单水柠檬酸、1.7 mmol·L-1辛烷磺酸钠、50 mol·L-1 EDTA的混合液-甲醇(87：13)；流速：0.2 mL·min-1; 柱温：35℃；进样量：20 μL。
1.6.3 标准曲线绘制精密称取适量5-HT、NE、DA对照品，溶于0.01 mol·L-1高氯酸溶液中，配成1 g·L-1混合储备液。取适量体积的储备液稀释成5个梯度浓度点，从低到高依次为3.125、6.25、12.5、25、50 μg·L-1，将标准品溶液由低浓度至高浓度进样，进样体积20 μL，对色谱峰进行积分，记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线(Fig 1)。
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| Fig 1 The standard curve of monoamine neurotransmitters |
采用SPSS 17. 0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示。组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD检验法，方差不齐时采用Dunnett's T3法进行分析。
2 结果 2.1 自主活动评分正常组树鼩非常活跃，在笼内不停上下翻转或水平移动；模型组活动能力下降，跳跃次数明显减少，总评分明显低于正常组(P＜0.01)；给予药物文拉法辛干预后，树鼩的活动能力明显提高(P＜0.01)，见Fig 2。
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| Fig 2 The independent activity score of tree shrews in each group (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model. |
如Fig 3所示，正常组树鼩对蔗糖水的喜好度明显高于普通蒸馏水。与正常组相比，模型组糖水偏好率明显下降(P＜0.01)；给予药物文拉法辛干预后，糖水偏好率明显增加(P＜0.05)。
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| Fig 3 Sugar preference rate of tree shrews in each group (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model |
如Fig 4所示，正常组树鼩逃避潜伏期时间(EL)最短，目标象限停留时间(ST)最长，说明正常组学习记忆能力均正常；模型组树鼩EL值明显上升(P＜0.01)，ST值下降(P＜0.05)，学习记忆能力较正常组均明显下降；给予文拉法辛干预后，EL值下降(P＜0.01)，学习能力提高，同时ST值增加，记忆能力改善，但无明显差异。
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| Fig 4 Comparison of learning and memory ability of tree shrews in each group (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model |
如Fig 5所示，与正常组相比，模型组树鼩血浆CRH、ACTH、COR含量均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)；与模型组相比，文拉法辛组树鼩血浆CRH、COR含量明显降低(P＜0.05)，ACTH含量则无明显变化。
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| Fig 5 Contents of CRH, ACTH and COR in plasma of tree shrews in each group (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs model |
如Fig 6所示，与正常组相比，模型组树鼩海马、前额叶皮质5-HT、NE、DA含量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)；杏仁核5-HT、NE、DA含量均下降，其中5-HT、DA下降值有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，文拉法辛组树鼩海马5-HT、NE、DA含量均明显升高(P＜0.05)；前额叶皮质、杏仁核各递质含量均呈上升趋势，其中前额叶皮质5-HT和NE含量明显升高(P＜0.05)，杏仁核5-HT含量明显上升(P＜0.05)。
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| Fig 6 Contents of monoamine neurotransmitters in different brain regions of tree shrew in each group (x±s, n=4) A:Hippocampus; B:Amygdala; C:Prefrontal cortex. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs model |
焦虑性抑郁较单纯的焦虑或抑郁更为复杂，本课题组前期开展了焦虑性抑郁疾病模型的相关研究，以啮齿类动物建立了焦虑性抑郁动物模型。而啮齿类与人类之间存在极大的种属差异, 因而需要建立非人灵长类动物模型进行补充。灵长类动物在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类更近似，用其进行焦虑性抑郁动物模型的建立，更能模拟该病的临床发病特点，是评价该疾病预防与治疗效果最有力的工具[9]。
树鼩是一种分布于我国西南地区的小型哺乳类动物，基因组研究表明，树鼩属于灵长类或是与灵长类亲缘关系最密切的种属，脑体质量比高，具有较为发达的神经系统和与人类相似的应激系统[10]，因此，相比其他非灵长类动物模型有不可替代的优势。文拉法辛是治疗各类抑郁症(包括伴有焦虑的抑郁症)及广泛性焦虑症的临床一线用药，因此，本实验选择文拉法辛作为验证焦虑性抑郁动物模型药物预见性的实验用药。
本研究中，模型组树鼩自主活动评分明显下降，符合焦虑性抑郁患者不爱活动的疾病特点。同时，焦虑性抑郁模型树鼩对糖水的快感缺失、学习与记忆能力均下降，与患者的临床表现类似，在给予药物治疗后，模型树鼩的行为表现均好转。综合行为学测试结果，说明本实验焦虑性抑郁树鼩模型建立成功。
持续的HPA轴亢进和脑区的神经递质失调是焦虑性抑郁疾病的重要发病机制之一[11]。本研究发现，模型组树鼩存在一定的HPA轴高亢现象，在给予文拉法辛干预后，模型树鼩的HPA轴高亢现象能得到一定的缓解。此外，本实验对动物多个脑区在焦虑性抑郁状态下的单胺递质含量变化进行了研究，发现各脑区单胺递质含量均呈现明显的下降，说明该疾病下脑内单胺递质严重失调，可能是多个脑区协同发生的。文拉法辛作为5-HT和NE的再摄取抑制剂，能通过提高脑内5-HT和NE浓度而发挥双重抗抑郁作用[12]。本研究发现，文拉法辛对模型树鼩各个脑区的5-HT、NE、DA含量均有一定的改善作用，其中对5-HT浓度的改变最为明显，与文献报道相符[13]。以上结果说明，文拉法辛能够逆转模型树鼩体内的HPA轴高亢以及脑区单胺递质失调等病理现象，由此可见慢性皮质酮注射诱导的焦虑性抑郁树鼩模型具有药物预见性，是模拟焦虑性抑郁临床发病特点的合适模型。
综上，本实验以树鼩为研究对象，采用慢性皮质酮注射的方法，建立了一种更接近人类临床的新型焦虑性抑郁动物模型，通过从动物行为、神经内分泌等角度综合评价，并进行药物预见性研究，证明该模型是一种成功的、能模拟人类疾病的焦虑性抑郁动物模型。
( 致谢: 本实验主要在湖南中医药大学中药粉体与创新药物国家重点实验室培育基地完成，在此对实验室各位老师及同学的帮助表示衷心的感谢！特别感谢昆明树鼩种质资源中心提供的实验树鼩及其饲养、卫生管理、实验技术等！)
| [1] | von Klitzing K, White L O, Otto Y, et al. Depressive comorbidity in preschool anxiety disorder[J]. J Child Psychol Psychiatry, 2014, 55(10): 1107-16. doi:10.1111/jcpp.12222 |
| [2] | 汪丽佳, 邱红梅, 蒋心惠, 等. CUS致大鼠抑郁行为涉及单胺递质合成酶表达下调[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(4): 527-31. Wang L J, Qiu H M, Jiang X H, et al. Down-regulation of monoamine neurotransmitter synthetase expression involved in CUS-induced depression of rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(4): 527-31. |
| [3] | Grippo A J, Ihm E, Wardwell J, et al. The effects of environmental enrichment on depressive and anxiety-relevant behaviors in socially isolated prairie voles[J]. Psychosom Med, 2014, 76(4): 277-84. doi:10.1097/PSY.0000000000000052 |
| [4] | 赵洪庆, 韩远山, 柳卓, 等. 焦虑性抑郁模型大鼠脑区单胺递质含量与神经因子表达的变化[J]. 中国实验动物学报, 2017, 25(4): 373-9. Zhao H Q, Han Y S, Liu Z, et al. Changes of content of monoamine neurotransmitters and expression of neurotrophic factors in brain regions of rat models of anxious depression[J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2017, 25(4): 373-9. |
| [5] | Zambello E, Fuchs E, Abumaria N, et al. Chronic psychosocial stress alters NPY system: different effects in rat and tree shrew[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010, 34(1): 122-30. doi:10.1016/j.pnpbp.2009.10.011 |
| [6] | Yao Y G. Creating animal models, why not use the Chinese tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)[J]. Zool Res, 2017, 38(3): 118-26. doi:10.24272/j.issn.2095-8137.2017.032 |
| [7] | 吴婷婷, 屈会化, 胡丽娜, 等. 基于树鼩体表面积的树鼩与人类及其它实验动物等效剂量换算系数的测算[J]. 中华中医药杂志, 2015, 30(1): 203-5. Wu T T, Qu H H, Hu L N, et al. Calculation of the conversion coefficients of equivalent dose among tree shrews, human and other species of experimental animals based on the body surface areas of tree shrews[J]. Chin J Tradit Chin Med Pharm, 2015, 30(1): 203-5. |
| [8] | 张君, 程笑, 杨欢, 等. 山奈酚对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响及机制探讨[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(1): 39-44. Zhang J, Cheng X, Yang H, et al. Effects of kaempferol on learning and memory in rats with chronic cerebral ischemia and possible mechanisms[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(1): 39-44. |
| [9] | van Kampen M, Kramer M, Hiemke C, et al. The chronic psychosocial stress paradigm in male tree shrews: evaluation of a novel animal model for depressive disorders[J]. Stress, 2002, 5(1): 37-46. doi:10.1080/102538902900012396 |
| [10] | Zhao F, Guo X, Wang Y, et al. Drug target mining and analysis of the Chinese tree shrew for pharmacological testing[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e104191. doi:10.1371/journal.pone.0104191 |
| [11] | Martisova E, Aisa B, Tordera R M, et al. Venlafaxine reverses decreased proliferation in the subventricular zone in a rat model of early life stress[J]. Behav Brain Res, 2015, 292: 79-82. doi:10.1016/j.bbr.2015.05.059 |
| [12] | Xing Y, He J, Hou J, et al. Gender differences in CMS and the effects of antidepressant venlafaxine in rats[J]. Neurochem Int, 2013, 63(6): 570-5. doi:10.1016/j.neuint.2013.09.019 |
| [13] | Balestri M, Calati R, Souery D, et al. Socio-demographic and clinical predictors of treatment resistant depression: a prospective European multicenter study[J]. J Affect Disord, 2016, 189: 224-32. doi:10.1016/j.jad.2015.09.033 |