2. 北京同仁堂科技发展股份有限公司，北京 100079;
3. 北京中医药大学北京中医药研究院，北京 100029
2. 2 Beijing Tongrentang Technologies Co., Ltd., Beijing 100079, China;
3. Beijing Institution of China Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
心肌缺血损伤是世界上导致突然死亡的主要原因之一。近年来，人们应用中药预防和治疗心肌缺血损伤已显示出良好的前景[1]。营心丹为北京同仁堂科研人员参考十香返生丹、安宫牛黄丸、再造丸、局方至宝丸、六神丸、冠心苏合丸、宽胸气雾剂及日本救心丹组方等历代名方，根据中医药理论，治病必求其本、扶正祛邪、标本兼顾的方针，以温开药物为主，佐使芳香开窍之品而成。前期研究发现其具有加强心肌收缩力、减慢心率、提高心脏抗缺氧效应，并可抑制血小板聚集，增强尿激酶活性，消除血栓形成，对心肌缺血所致的冠心病心绞痛疗效确切[2]。
张远等[3]实验表明，静脉注射营心丹(5 mg·kg-1)对静脉注射垂体后叶素致家兔心肌缺血模型无明显改善，但个别动物改善明显。本研究在此研究背景下，建立舌下静脉注射垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型，采用预防灌胃给药，观察营心丹对心肌缺血的预防性保护作用，并探讨其可能的作用机制。
1 材料 1.1 动物SPF级SD大鼠96只，♀♂各半，体质量(180±20) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SYXK京2015-0033。
1.2 试剂生理盐水注射液(石家庄四药有限公司，批号：1606033202)；4%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：T20080902)；肌酸激酶(CK)试剂盒(批号：20170622)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)试剂盒(批号：20170527)、糖原磷酸化同工酶BB(glycogen phosphorylase isoenzyme BB，GPBB)试剂盒(批号：20170601)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)试剂盒(批号：20170601)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)试剂盒(批号：20170601)，均购于南京建成生物工程研究所。
1.3 药品硝苯地平(山西云鹏制药有限公司，批号：F170101)；营心丹(北京同仁堂科技发展股份有限公司，批号：15084127)；垂体后叶素(pituitrin，pit)注射液(南京新百药业有限公司，批号：H32026638)。
1.4 仪器TE2101-L电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司)；Multifuge X3R高速冷冻离心机(中国赛默飞世尔科技有限公司)；Eppendorf AG离心机(德国Eppendorf)；TW21水浴锅(德国JULABO)；ZH-2旋涡混合振荡器(天津药典标准仪器厂)；ECG-9020K心电图机(日本光电株式会社)；SpectraMax M5酶标仪(美国Molecular Devices)。
2 方法 2.1 动物分组与造模SD大鼠96只，♀♂各半，适应性饲养5 d，筛选出60只肢体Ⅱ导联心电图正常(麻醉后S点不高于基线)的大鼠，d 6将大鼠随机分为6组：生理盐水组、模型组、阳性药硝苯地平组、营心丹高、中、低剂量组，每组10只。从d 6起，生理盐水组和模型组灌胃给水1周；阳性药硝苯地平组灌胃硝苯地平水溶液1周，给药剂量为12.6 mg·kg-1；营心丹高、中、低剂量组灌胃营心丹高、中、低水溶混悬液1周，给药剂量分别为25.2、12.6、6.3 mg·kg-1；给药(水)体积为10 mL·kg-1。最后一次给药1 h后，舌下静脉注射pit 1 U·kg-1建立急性心肌缺血模型。舌下静脉注射pit引起大鼠心肌缺血时，心电图ST段的变化可分为2期，第1期注射后5~30 s T波升高，ST段抬高(＞0.1 mV)；第2期注射后30 s至数分钟，ST段下移，T波降低，平坦，双向或倒置，心率减慢，P-R及Q-T间期延长，出现第1期或第2期缺血性变化为阳性，否则为阴性[4]。本实验模型组注射垂体后叶素后30 s前ST段抬高超过0.1 mV，30 s后ST段下移，T波低平或者倒置，与文献报道一致，说明造模成功。
2.2 指标检测 2.2.1 心肌缺血大鼠心电图变化的测定按10 mL·kg-1腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧固定于鼠板，四肢皮下插入针灸针，连接肢导联，记录肢体Ⅱ导联心电图；以PP连线为基线，记录给pit前及注射完pit后0、5、10、15、30 s及1、2、3、4、5、10 min的心电图ST段值，并比较各组注射pit前后ST段变化。观察并记录ECG中室性心律失常发生率及心肌缺血阳性率。当心电图出现宽大或畸形的QRS波，无P波或P波倒置逆反，心律不齐等一项者记为心律失常。当出现下列指征一项者即为心肌缺血阳性：J点升高1.5 mV以上，T波降低50%以上、双向、倒置，ST水平升高0.1 mV或下移0.5 mV，心律不齐。
2.2.2 心肌缺血大鼠血清生化指标的检测测定心电图后，大鼠腹主动脉取血6 mL，4℃静置1 h，以3 500 r·min-1低温离心10 min，分装血清于EP管中，-80 ℃保存。测定时取出血清，快速解冻，严格按照试剂盒说明，测血清中CK、CK-MB、GPBB、cTnI、cTnT的活性或含量。
2.3 统计学处理应用SAS V8软件对结果进行统计分析，数据以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析LSD法和两组独立样本非参数检验，率的比较采用χ2检验。
3 结果 3.1 营心丹对心肌缺血大鼠肢体Ⅱ导联心电图ST段变化的影响本实验以注射完pit为0 s，由Tab 1、Fig 1可知，给药后1 h，生理盐水组与给药组差异无显著性，表明给药对正常大鼠的心电图没有影响。舌下静脉注射pit后，模型组0 s时ST段抬高超过0.1 mV，3 min后ST段抬高小于0.1 mV，ST段下移；预防给药组0 s时ST段几乎无变化，与模型组差异有显著性(P＜0.01)，说明预防给药组起效时间从0 s开始。营心丹高剂量组ST段最大变化量为0.05 mV，营心丹中剂量组ST段最大变化量为0.06 mV，营心丹低剂量组ST段最大变化量为0.09 mV，最大变化量ST高＜ST中＜ST低，可知不同剂量的营心丹对于减轻pit致心肌缺血的作用强度不同，但P＞0.05，差异无统计学意义。营心丹高剂量组0 s至4 min的ST段变化量与模型组差异有显著性(P＜0.01)，营心丹中剂量组0 s至2 min的ST段变化量与模型组差异有显著性(P＜0.01)，营心丹低剂量组0 s至3 min ST变化量与模型组差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
Before pit injection/mV | ST range of change/mV | |||||||
| 0 s | 5 s | 10 s | 2 min | 3 min | 4 min | 5 min | 10 min | |||
| NS | - | 0.07±0.06 | 0.01±0.03** | 0.02±0.02** | 0.01±0.03** | 0.02±0.03** | 0.02±0.03** | 0.02±0.03** | 0.01±0.02* | 0.02±0.02 |
| Model | - | 0.01±0.08 | 0.12±0.10 | 0.19±0.15 | 0.15±0.08 | 0.10±0.10 | 0.09±0.11 | 0.09±0.09 | 0.06±0.07 | 0.02±0.03 |
| Nifedipine | 12.6 | 0.03±0.03 | 0.00±0.00** | -0.01±0.02** | 0.01±0.02** | 0.02±0.03** | 0.01±0.03** | 0.01±0.02** | 0.01±0.02* | 0.00±0.02 |
| Yingxindan | 25.2 | 0.04±0.06 | 0.02±0.03** | 0.05±0.07** | 0.04±0.05** | 0.02±0.05** | 0.02±0.04** | 0.01±0.04** | 0.01±0.04* | 0.00±0.00 |
| 12.6 | 0.02±0.05 | 0.03±0.09** | 0.06±0.11** | 0.05±0.05** | 0.04±0.05** | 0.03±0.05* | 0.03±0.05* | 0.01±0.06* | 0.01±0.03 | |
| 6.3 | 0.04±0.06 | 0.03±0.06** | 0.05±0.05** | 0.09±0.10* | 0.01±0.05** | 0.00±0.04** | 0.03±0.04* | 0.00±0.04* | 0.00±0.02 | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | ||||||||||
|
|
Fig 1 Typical electrocardiogram in each group
(horizontal axis 0.02 s·mm-1, vertical axis 0.1 mV·mm-1) A: NS; B: Model(after pit 5 s); C: Nifedipine(after pit 5 s); D: High dose of Yingxindan(after pit 5 s); E: Medium dose of Yingxindan(after pit 5 s); F: Low dose of Yingxindan(after pit 5 s) |
各给药组均能降低大鼠舌下静脉注射pit后心肌缺血阳性率及心律失常发生率。其中，营心丹高剂量组和硝苯地平组降低心肌缺血阳性率最为明显，而各给药组都能明显降低心律失常率(Tab 2)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Myocardial ischemia(PCS) | Arrhythmia | Myocardial ischemia rate/% | Arrhythmia rate/% |
| NS | - | - | - | - | - |
| Model | - | 10 | 10 | 100 | 100 |
| Nifedipine | 12.6 | 0 | 2 | 0** | 20** |
| Yingxindan | 25.2 | 4 | 3 | 40** | 30** |
| 12.6 | 6 | 4 | 60* | 40** | |
| 6.3 | 8 | 5 | 80 | 50** | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | |||||
模型组大鼠血清中CK、CK-MB的活性明显提高，与生理盐水组比较差异有显著性(P＜0.01)。阳性药硝苯地平组和营心丹高剂量组血清中CK、CK-MB活性均明显降低，与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)；营心丹中剂量组大鼠血清中CK、CK-MB的活性亦明显降低，与模型组差异有显著性(P＜0.05)；营心丹低剂量组大鼠血清中的CK、CK-MB的活性虽与模型组比较无明显差异，但是均有一定的降低趋势。此外，营心丹高、中、低剂量组血清中CK、CK-MB的活性逐渐增大(Tab 3)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | CK/kU·L-1 | CK-MB/kU·L-1 | GP-BB/mg·L-1 | cTnT/μg·L-1 |
| NS | - | 0.67±0.13** | 0.14±0.07** | 0.10±0.05** | 0.95±0.68** |
| Model | - | 1.12±0.33 | 0.29±0.12 | 0.18±0.07 | 1.69±0.62 |
| Nifedipine | 12.6 | 0.69±0.24** | 0.17±0.06** | 0.06±0.05** | 0.86±0.42** |
| Yingxindan | 25.2 | 0.75±0.19** | 0.18±0.08** | 0.10±0.04** | 0.77±0.27** |
| 12.6 | 0.84±0.25* | 0.19±0.10* | 0.12±0.06* | 0.85±0.41** | |
| 6.3 | 0.95±0.41 | 0.22±0.11 | 0.13±0.08 | 0.87±0.61** | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | |||||
模型组大鼠血清中GP-BB的含量升高，与生理盐水组相比差异有显著性(P＜0.01)。阳性药硝苯地平组、营心丹高、中剂量组大鼠血清中GP-BB含量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)；营心丹低剂量组大鼠血清中GP-BB含量虽与模型组比较差异无显著性，但有一定的降低趋势。此外，营心丹高、中、低剂量组血清中GP-BB的含量逐渐增大(Tab 3)。
3.3.3 对血清中cTnI、cTnT的影响应用两组独立样本非参数检验方法对模型组大鼠血清中cTnI含量分别与其他各组进行显著性差异分析可知，模型组cTnI含量均大于其他各组，与生理盐水组相比差异有显著性(P＜0.01)，阳性药硝苯地平组、营心丹高、中剂量组大鼠血清中cTnI含量明显降低(P＜0.01，P＜0.05)；营心丹低剂量组大鼠血清中cTnI的含量与模型组相比无明显差异，但有一定降低趋势。营心丹高、中、低剂量组cTnI的含量逐渐增大(Tab 4)。非参数检验分析表明，营心丹高、中剂量组间cTnI的含量差异有显著性(Z=2.53，P＜0.01)。硝苯地平组、营心丹高、中、低剂量组大鼠血清中cTnT的含量明显降低(P＜0.01)。且营心丹高、中、低剂量组血清中的cTnT含量逐渐增大(Tab 3)。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
Rank mean | Z | P |
| NS | - | 6.80 | 2.76 | 0.003 |
| Nifedipine | 12.6 | 7.00 | 2.60 | 0.005 |
| Yingxindan | 25.2 | 6.40 | 3.06 | 0.001 |
| 12.6 | 8.20 | 1.70 | 0.04 | |
| 6.3 | 9.70 | 0.57 | 0.29 |
大鼠舌下静脉注射大剂量pit，可使冠状动脉痉挛[5]、心脏灌流不足、全身小血管收缩，导致血压升高、心脏后负荷加重，最终造成心肌缺血缺氧[6]。垂体后叶素所致的心肌缺血损伤是渐进性的，其心电图变化类似于人体急性心肌缺血损伤，并且操作方法简便，实验周期短，广泛用于筛选抗心肌缺血药物的研究[7]。
本实验通过复制舌下静脉注射pit致大鼠心肌缺血模型，对营心丹进行药效学评价。肢体Ⅱ导联心电图表明，营心丹可明显减轻大鼠舌下静脉注射pit致心肌缺血模型的ST段变化量。营心丹的作用机制可能通过扩张血管，从而降低外周阻力、心脏负荷、心肌的氧耗，以维持心肌耗氧和供氧的平衡，缓解心肌缺血症状。
当心肌细胞发生病变时，由于膜的完整性破坏，致通透性增高，细胞中的CK迅速释放入血，血清中CK的含量迅速上升。目前认为在心肌梗死的诊断中，测定CK的活性比心电图更可靠，而CK中心肌型同工酶(CK-MB)诊断的特异性最高[8-9]。GPBB是心肌细胞中含量较高的酶，该酶对心肌缺血缺氧敏感，在心肌损伤早期(小于4 h)即可释放入血，是急性心肌损伤早期诊断的一项很好的指标[10]。静脉注射pit致心肌缺血模型是急性心肌损伤模型，本实验剂量的垂体后叶素注射后作用时间仅仅10 min，不足以引起心肌严重损伤，而GPBB是心肌损伤早期较灵敏的指标，选择该指标可以更加准确地判断药物药效作用时段。当心肌细胞因缺血缺氧等因素遭破坏时，游离型cTnI和cTnT可首先迅速从细胞中释放入血，其时间和CK-MB相当或稍早，但其从肌原纤维上降解的过程持续时间很长，可在血中保持较长时间的升高，故兼有CK-MB升高较早和诊断时间窗长的优点[11]，可作为心脏损伤的指标[12]。cTnI和cTnT相比，后者在心肌损伤疾病诊断方面有更高的阳性预测率[13]。本实验结果表明，营心丹高、中、低剂量均能降低CK、CK-MB、GPBB、cTnI的活性或水平，随剂量升高而变小；营心丹高、中、低剂量均可明显降低cTnT的水平，cTnT的含量随剂量的升高而降低。通过检测指标可知营心丹对心肌损伤早期阶段有较好的作用。
综上所述，营心丹作用机制可能与改善缺血心肌收缩功能、抗氧化、减轻心肌损伤有关，其详细机制有待进一步研究。
( 致谢: 本实验在北京市药品检验所药理毒理科室实验室完成，感谢各位老师和同学对实验的指导和帮助。)
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