2. 山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062;
3. 国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东 济南 250062;
4. 山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062
2. Institute of Materia Medica, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China;
3. Key Laboratory for Biotech-Drugs Ministry of Health, Jinan 250062, China;
4. Key Laboratory for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Jinan 250062, China
近年来，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着我们的健康以及生命。DM若未得到及时的诊断和治疗，会引发多种并发症[1]。其中，心血管并发症已经成为DM患者发病率及死亡率的主要危险因素[2-3]，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)则被视为DM独立的并发症。DM高血糖状态会促使心血管产生病变，且DCM患者的预后很差，死亡率极高。
研究发现，Wnt/β-catenin经典信号通路对DM的进程起着至关重要的作用，与心脏重构、心肌梗死、心力衰竭、心律失常等病理过程密切相关[4]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)作为Wnt/β-catenin信号通路重要的一个下游信号分子，调控着糖原的合成，GSK-3β的过表达可能刺激胰岛素抵抗的产生，与DM的发生发展有着密不可分的关系[5]。有研究显示，在DCM的发生发展过程中，Wnt/β-catenin信号通路被激活，进一步促进DCM的发生发展[6]。另有研究显示，抑制GSK-3β后，能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的传导，能够对DCM的损伤进行修复[7]。故本实验采用能够对GSK-3β产生抑制作用的合成药物甲异靛(meisoindigo，Me)，有文献报道[8]，其对GSK-3β有抑制作用，已应用于慢性粒细胞白血病中，但对DCM的作用尚未见报道。本文通过检测Me对Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达变化的影响，探讨Me在DCM修复过程中的作用机制，为DCM的诊断治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及模型建立健康♂SD大鼠60只，SPF级，体质量(170±20)g，购自济南朋悦实验动物有限公司。大鼠经过1周的适应性喂养期，按体重均衡的原则，随机分为正常对照组(A)20只，其中4周、8周正常对照组各10只；DM模型组(B)40只。B组大鼠禁食16 h后，一次性腹腔注射链脲佐菌素(60 mg·kg-1，pH=4.5柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，4℃配制，现用现配)，A组大鼠注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。造模后72 h，尾静脉采血测空腹血糖值(fasting blood glucose, FBG)，以FBG≥ 16.7 mmol·L-1，并出现多饮、多食、多尿和体质量下降者为DM模型成功者。B组造模成功组随机分为4周DM模型组、4周Me给药组、8周DM模型组、8周Me给药组，每组10只。给药组20 mg·kg-1灌胃给药，其余组别分别以同体积的蒸馏水灌胃。A、B两组大鼠均以普通饲料和蒸馏水继续饲养。
1.2 试剂链脲佐菌素、戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；血糖试纸(强生中国医疗器材有限公司)；生物素标记山羊抗兔IgG/鼠IgG二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Western blot一抗、二抗去除液、裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所；ProSieve Color protein markers(美国Lonza Rockland公司)；增强型化学发光试剂(美国Millipore公司)；单克隆抗体GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、NF-κB p65、β-actin，均购自美国Cell Signaling Technology公司；Wnt2抗体(美国Epitomics公司)；p-NF-κB p65抗体(Ser536，Santa Cruz公司)。
1.3 标本收集各周期末，尾静脉采血测血糖值。大鼠麻醉，仰位固定，开胸，腹主动脉取血，5~10 mL每只，3 000 r·min-1离心10 min，取上清，分装到EP管，-20℃保存待测。迅速取出心脏，用预冷生理盐水洗净，滤纸吸干，沿心室壁剪开，剔除血管、脂肪等非心肌组织，分为左心、右心，分别称取心脏质量(HW)和左心室(含室间隔)质量(LVW)，并计算心脏(左心)指数=心脏(左心室)质量(mg)/体质量(g)。将左心分为两部分：一部分用4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、包埋，制成心脏组织石蜡块；另一部分置于冻存EP管，液氮保存待测。
1.4 HE染色取正常对照组及各时间点模型组、给药组心肌组织，制作石蜡切片，常规脱蜡至水，苏木精染色10 min，流动的水稍加冲洗，体积分数1%的的盐酸乙醇分化，流动水冲洗数分钟，伊红染色5 min，流动水稍加冲洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片。Eclipse TE 2000-S荧光显微镜拍照(日本Nikon)，观察心肌组织病理结构的变化。
1.5 免疫组织化学染色取各组石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤，H2O2溶液封闭30 min，柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压3 min，PBS洗涤后与相应一抗4℃湿盒过夜，次日滴加与辣根过氧物标记的二抗，孵育20 min。二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木精对比染色，自来水洗返蓝，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，于免疫荧光显微镜下拍照，观察结果。
1.6 Western blot检测取各组别大鼠心肌组织，制备组织匀浆，每20 mg组织加入100~200 μL含1 mmol·L-1 PMSF的裂解液，4℃下14 000×g离心10 min，取上清，分装于EP管，-20℃保存。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。40 μg总蛋白上样量以浓度为10%的凝胶电泳分离。冰浴恒流(300 mA)下湿法转膜2 h，体积分数5%的BSA封闭液室温封闭1 h后，与相应的一抗4℃孵育过夜。TBS-T洗液洗涤，与辣根过氧化物标记的二抗共孵育，增强型化学发光试剂进行显色，并用灰度分析软件定量分析。
1.7 统计学分析数据以x±s表示，应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用方差分析及t检验。
2 结果 2.1 DM大鼠模型建立情况实验期间，正常对照组大鼠状态良好、健壮、皮毛柔顺有光泽，自主活动无异常，对外界反应灵敏，无死亡。与正常对照组大鼠相比，DM模型组大鼠逐渐消瘦，精神萎靡，皮毛黯淡无光泽，腥臊臭味加重等；且随着时间的增加，多饮、多食、多尿和消瘦加重，生存状态越来越差。与DM模型组比较，Me给药组大鼠体质量稍有增加，精神较DM模型组略好；随着时间的增加，给药组大鼠体质量增加明显，生存状态明显好转。
2.2 大鼠体质量、空腹血糖值及心脏各指标DM模型组大鼠与正常对照组大鼠比较，空腹血糖值明显升高，体质量明显下降，心脏和左心室质量明显降低(P＜0.01)。Tab 1显示，给予大鼠4周Me治疗后，相较于正常对照组，Me组空腹血糖值明显升高，体质量明显下降，心脏和左心室质量明显降低，心脏指数及左心指数升高，大鼠的身体状况并没有向好的趋势发展。由此可见，4周Me给药组相对于DM模型组，疗效并不是很明显，并出现了轻微恶化现象。但随着时间的延长，给药至8周时，Me给药组的体质量、血糖值、心脏指数及左心指数较之DM模型组都有了明显好转(P＜0.05)。见Tab 1、2。
| Control | DM | Me | |
| BW/g | 322.2±22.741 | 191.2±34.353** | 150.6±23.597**## |
| FBG/mmol·L-1 | 4.95±0.622 | 28.57±4.481** | 29.55±4.137** |
| HW/g | 0.863±0.063 | 0.519±0.079** | 0.468±0.083 ** |
| LVW/g | 0.696±0.064 | 0.413±0.066** | 0.377±0.066** |
| HW/BW/mg·g-1 | 2.682±0.168 | 2.730±0.164 | 3.097±0.140**## |
| LVW/BW/mg·g-1 | 2.163±0.177 | 2.173±0.186 | 2.496±0.130** |
| BW: Body weight; FBG: Fast blood glucose; HW: Heart weight; LVW: Left ventricular weight. **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DM | |||
| Control | DM | Me | |
| BW/g | 376.2±29.953 | 175.0±38.411 ** | 227.6±48.866**# |
| FBG/mmol·L-1 | 4.98±0.705 | 30.9±3.429** | 13.12±7.700*## |
| HW/g | 1.003±0.096 | 0.513±0.096** | 0.6±0.113 ** |
| LVW/g | 0.822±0.085 | 0.418±0.082** | 0.489±0.094** |
| HW/BW/mg·g-1 | 2.666±0.169 | 2.972±0.322** | 2.656±0.148# |
| LVW/BW/mg·g-1 | 2.184±0.138 | 2.421±0.269* | 2.166±0.153# |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DM | |||
如Fig 1所示，正常对照组大鼠心肌细胞形态正常，排列整齐，细胞核分布均匀，无变形、坏死等变化。DM模型组大鼠心肌细胞中能看到不同程度的病变，心肌细胞明显增大，胞质丰富，排列紊乱，细胞核由正常的圆形或椭圆变为长杆状，且大小不规则，尤其是8周DM模型组的大鼠，局部心肌细胞凝固性坏死，胞质嗜酸性增强，核固缩深染，纤维组织增生，坏死灶内淋巴细胞大量增生。较之DM模型组，Me给药组心肌组织中则偶见心肌细胞点灶状炎症浸润坏死灶，有不同程度的心肌肥大、心肌纤维化等病变缓解的症状。
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| Fig 1 HE staining of myocardium of DM rats (×400) A:Control group; B:4 wk DM; C:4 wk Me; D:8 wk DM; E:8 wk Me |
如Fig 2所示，DM模型组中GSK-3β蛋白在心肌中的表达要比正常对照组中略多，颜色较深，尤其是棕黄色的区域，则是表现为蛋白的阳性表达范围，随着时间的延长，8周时DM模型组的阳性表达更为明显；而Me给药组的GSK-3β蛋白阳性表达则比DM模型组的要稍少，细胞质、细胞核均有表达。p-GSK-3β、β-catenin蛋白在DM模型组中的表达，比正常对照组要多，8周DM模型组中p-GSK-3β蛋白表达棕黄色区域更多，阳性表达更加明显；与DM模型组相比，Me给药组中p-GSK-3β蛋白的表达相应减少。NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白在DM组中除了有棕黄色阳性表达现象，还出现有染色较深的区域，主要为细胞核表达阳性较正常对照组的表达水平有所增加，在Me给药组中，NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白的细胞核表达则有不同程度的减少，细胞质、细胞核表达均匀。
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| Fig 2 Immunohistochemistry of proteins expression of myocardium in DM rats (×400) |
Western blot结果表明(Fig 3)，DM模型组大鼠心肌中GSK-3β以及p-GSK-3β蛋白的表达变化相对于正常对照组以及Me给药组，差异均无显著性(P>0.05)，然而DM模型组p-GSK-3β/GSK-3β的值相对于正常组明显升高(P＜0.05)，且Me给药组明显降低(P＜0.05)；DM模型组大鼠从4周到8周期间，Wnt2、β-catenin蛋白的表达水平与正常对照组比较明显升高(P＜0.05)，Me给药至8周时，Wnt2、β-catenin蛋白表达较正常对照组也有明显下降(P＜0.01)；NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白在4周DM模型组大鼠心肌中明显升高(P＜0.01)，随着时间的延长，到8周时，NF-κB-p65蛋白的表达在Me给药组中较DM模型组明显减少(P＜0.01)；p-NF-κB-p65蛋白在DM模型组中的表达与正常对照组相比明显上升(P＜0.01)，Me给药组中p-NF-κB-p65的表达较DM模型组大鼠明显下降(P＜0.01)。
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| Fig 3 The protein levels of GSK-3β, p-GSK-3β, Wnt2, β-catenin, NF-κB-p65, p-NF-κB-p65 in total protein extracts of myocardium from DM rats analyzed by Western blot (x±s, n=10) A: Representative Western blot analysis of the time-dependent changes of protein levels; B: Bar graph of quantification of protein levels(fold of intensity of bands with β-actin). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 4 wk DM group |
DM可引起机体多个脏器的损害，其中心肌损伤是1型DM常见的并发症之一。GSK-3是进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种细胞及生物体内都有表达。在哺乳动物中，GSK-3来自两个紧密相关的由不同的基因编码的亚型GSK-3α、GSK-3β，其中以GSK-3β的作用为主[9]。GSK-3β是调控血糖稳态的重要分子，参与许多DM发生发展的细胞进程，对心肌肥大也有一定影响，抑制GSK-3β能够缓解DM大鼠心肌肥大和心衰的症状[10]。Wnt/β-catenin经典信号通路在DM中的作用研究也越来越广泛。研究发现[11]，Wnt/β-catenin通路在1型型糖尿病心肌病大鼠心肌组织中，处于被激活状态，表明Wnt/β-catenin信号通路的激活对糖尿病大鼠心肌损伤起着重要作用。
本实验采用1次性腹腔注射链脲佐菌素的建模方法[1]，建立1型糖尿病大鼠模型，与正常对照组比较，DM模型组大鼠空腹血糖值明显升高，并呈现持续的高血糖，体质量明显低于正常对照组，心肌组织中局部心肌细胞凝固性坏死，胞质嗜酸性增强，坏死灶内淋巴细胞大量增生；与DM模型组相比，4周Me给药组，心脏指数、左心指数各项指标都有一定程度的恶化，可能是由于对早期DM模型大鼠给药后，上调了大鼠体内p21蛋白的表达，而p21蛋白表达的升高能够使大鼠体内p65蛋白表达略有上升，使Me给药组大鼠体内Wnt通路愈发处于激活的状态，从而使DM模型组大鼠各项生命指征没有好转的现象[12-13]；而给药至8周，DM大鼠的各项指征比DM模型组都有了好转的迹象，HE染色显示其心肌组织中则偶见心肌细胞点灶状炎症浸润坏死灶，有不同程度的心肌肥大、心肌纤维化等病变缓解的症状，表明Me对DM大鼠作用一定时间后，能够通过抑制GSK-3β的表达，抑制Wnt信号通路的传导，对DM大鼠的心肌损伤具有一定的缓解作用。
GSK-3β可调控NF-κB、JNK、MAPK等多条信号通路，对DCM的病理生理过程产生影响。有研究显示[14]，对GSK-3β进行抑制，早期能够激活Wnt信号通路，增加β-catenin的表达水平，同时还能够影响NF-κB通路的转导，但β-catenin的表达的升高与NF-κB通路信号的转导之间可能是独立起作用的。另有研究报道[15]，有的抑制剂产生抑制GSK-3β的作用，通过抑制GSK-3β的磷酸化，从而抑制β-catenin的表达水平，继而抑制Wnt信号通路的激活及信号转导。本研究Western blot结果表明，Me给药组大鼠体内GSK-3β蛋白总量变化不大，而p-GSK-3β/GSK-3β的值相对于正常组明显升高，说明甲异靛该药对GSK-3β总量及其磷酸化影响不大，而是通过对GSK-3β进行抑制，达到抑制效果的。Western blot结果中，4周和8周DM模型组大鼠心肌中的Wnt2、β-catenin蛋白表达均有升高，特别是到8周时，免疫组化结果也表现为细胞核表达增加，说明Wnt/β-catenin信号通路被激活。而Me给药组4周时，GSK-3β、Wnt2、β-catenin的表达略有升高，这可能是Me对GSK-3β进行抑制之后，在早期会使其内源性抑制剂增加，能够产生激活Wnt信号通路的作用，而随着时间的增加，给药至8周时，这些蛋白的表达明显降低，免疫组化结果显示，细胞核表达减少，细胞核及细胞质表达均匀，表明Wnt/β-catenin信号转导的减少，信号通路受到抑制。对于GSK-3β作用的下游因子NF-κB-p65、p-NF-κB-p65的表达，在4周、8周DM大鼠心肌中表达升高，而在给药组中则明显减少，提示Me对GSK-3β抑制后，能够对NF-κB信号通路也产生影响，主要是通过减少NF-κB-p65蛋白的磷酸化以及减少DM大鼠心肌中NF-κB-p65的总量得以实现。而Wnt/β-catenin及NF-κB两条通路之间是如何在DM大鼠发生发展过程中产生作用的，还有待进一步实验研究。
DCM是DM心血管并发症的主要组成部分，明确其发生发展过程中心肌相关指标的变化，对其尽早诊断治疗有重要作用。本实验发现Me抑制大鼠体内的GSK-3β蛋白的表达，继而对Wnt/β-catenin信号通路进行抑制，并下调其下游相关蛋白因子的表达，参与了DM大鼠心肌损伤的修复过程，揭示了Wnt/β-catenin通路的激活以及NF-κB表达的升高均对DM的发生发展起着至关重要的作用，该结果将为DCM的早期诊断及治疗提供理论依据。
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