2. 大理大学 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心, 云南 大理 671000;
3. 大理大学 中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南 大理 671000;
4. 四川好医生药业集团，四川 成都 610000
2. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics, Dali, Yunnan 671000, China;
3. Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali, Yunnan 671000, China;
4. Good Doctor Pharmaceutical Group, Chengdu 610000, China
美洲大蠊(Periplaneta americana)俗称“蟑螂”，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊科昆虫，其入药始载于《神农本草经》，被列为中品，谓“味咸寒; 主血瘀，症坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒，无子”[1]。研究发现，美洲大蠊提取物具有抗癌、抗肿瘤、抗纤维化、抗菌、抗炎、消肿止痛、组织修复、黏膜保护等功效[2]。近年来笔者所在的团队研究发现，美洲大蠊对肿瘤细胞及荷瘤小鼠的免疫调节作用明显[3]，因此推测美洲大蠊主要是通过调节机体免疫系统而发挥抗癌、抗炎等作用的。结合前期研究，采取水提醇沉新工艺从美洲大蠊中提取所得的具有抗免疫性疾病溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的活性部位Ento-A[4-5]，以研究其对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，为后续研究Ento-A免疫调控机制及开发抗UC新药提供一定的实验依据。
1 材料 1.1 实验动物SPF级昆明小鼠60只，♀♂各半，6~8周龄，体质量(20±2)g，由湖南景莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2013-0004。
1.2 药品美洲大蠊提取物Ento-A(云南省昆虫生物医药研发重点实验室提供，批号：20140615);黄芪多糖注射液(河南复兴动物药业有限公司，批号：20160624);注射用环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司，0.2 g，批号：16070425)。
1.3 试剂都氏试剂(批号：SLBQ0489V)、ConA(Lot：SLBN5209V)购自Sigma公司; RPMI 1640、胎牛血清(Gibco公司); MTT、中性红、二甲基亚砜(DMSO)，均购自Solarbio公司; 小鼠淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物工程有限公司); 豚鼠血清、绵羊血由大理大学动物实验中心提供。
1.4 仪器Gen5型酶标分析仪(基因有限公司); XFA6000全自动动物血细胞分析仪(南京普朗医疗设备有限公司); T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用有限公司); 5510型CO2培养箱(美国NUAIRE公司); CKX41型倒置显微镜(奥林巴斯有限公司); SW-CJ-2FD双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)。
2 方法 2.1 实验动物分组及给药将60只昆明小鼠，随机分为6组：空白对照组、模型对照组、阳性药组(黄芪多糖注射液，160 mg·kg-1)、Ento-A高、中、低剂量组(400、200、100 mg·kg-1)。除空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组于给药前连续腹腔注射80 mg·kg-1的环磷酰胺3 d，复制小鼠免疫抑制模型; 空白对照组和模型对照组灌胃给予等量生理盐水，其余各组给予相应剂量药物10 d; 各组均于给药d 1、3、5注射体积分数为0.20的绵羊红细胞(SRBC)0.2 mL致敏; 并于造模小鼠给药d 7注射100 mg·kg-1环磷酰胺1次用于加强免疫，空白对照组按相同操作程序注射生理盐水。
2.2 外周血细胞测定末次给药后1 h，小鼠摘眼球取血，取20 μL全血放入预稀释液中，用动物血细胞分析仪以预稀释模式测定外周血细胞。
2.3 溶血素含量测定[6]末次给药后1 h，小鼠摘眼球取血，2 000 r·min-1离心10 min，取血清，于56℃水浴30 min以灭活补体，对血清溶血素效价进行滴定。取血清稀释相应倍数，置于EP管内，再加入0.5 mL 5%的绵羊红细胞，1.0 mL稀释的豚鼠血清，空白对照管内用生理盐水代替小鼠血清。将所有试管于37℃水浴锅中恒温10 min，取出放入冰浴中终止反应; 2 000 r·min-1离心10 min，取上清液1.0 mL，加都氏试剂3.0 mL于管内; 同时取5%的绵羊红细胞0.25 mL，都氏试剂4.0 mL于另一支试管内充分摇匀，放置10 min，以对照管做空白，于540 nm波长下，分别测量吸光度值，计算半数溶血值。半数溶血值公式为：HC50=(样品吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度)×稀释倍数。
2.4 吞噬指数的测定[8-9]于末次给药后1 h颈椎脱臼处死小鼠，放入体积分数为0.75的乙醇中浸泡3 min，腹腔注入4 mL无菌PBS缓冲液(含10%胎牛血清)，2 mL空气，轻揉腹部3 min，无菌条件下打开腹腔，吸取腹腔液于离心管中，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清液收集巨噬细胞，PBS洗涤细胞2次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度至5×109·L-1，以每孔100 μL接种于96孔板，置37℃、5% CO2培养箱中培养，3 h后用PBS洗去未贴壁细胞，加入0.1%的中性红溶液200 μL，孵育3 h。弃上清，洗涤细胞3次，每孔加入200 μL酸性乙醇溶解液(乙醇、乙酸等体积混合)，4℃静置过夜，于520 nm波长下测定OD值，并计算吞噬率/%=实验组OD值/对照组OD值×100%。
2.5 脏器指数的测定取出小鼠脾脏和胸腺，去除脂肪和筋膜组织，称取重量，计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。
2.6 脾T淋巴细胞增殖实验[6-7]取出小鼠的脾脏，制备脾脏细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用培养基调整细胞浓度至5×109·L-1，加入100 μL细胞悬液到96孔板中, 并加入ConA(终浓度为10 mg·L-1)刺激。置于37℃、5% CO2培养箱中培养68 h。每孔加20 μL MTT(5 mg·L-1)，继续培养4 h后，移去微孔中所有液体，再加入150 μL DMSO终止反应，振荡10 min，酶标仪检测570 nm处OD值。
2.7 统计学方法以SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。两两比较经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用两两比较LSD法进行统计，方差不齐的实验数据采用秩和检验进行统计分析。
3 结果 3.1 美洲大蠊提取物Ento-A对小鼠免疫器官脏器指数的影响如Tab 1所示，注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型对照组的脾脏指数、胸腺指数明显降低(P < 0.01)，提示造模成功; 与模型对照组比较，各给药组脾脏指数和胸腺指数均有所增加; Ento-A高、中、低剂量组脾脏指数明显增加(P < 0.01)，并呈良好剂量依赖性，胸腺指数呈剂量依赖性上升趋势，其中高剂量组增加明显(P < 0.01)，见Fig 1、2。
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| Fig 1 Effect of Ento-A on spleen in mice |
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| Fig 2 Effect of Ento-A on thymus in mice |
| Group | Dose /mg·kg-1 |
Spleen index /mg·g-1 |
Thymus index /mg·g-1 |
| Control | - | 3.84±0.68 | 2.93±0.70 |
| Model | - | 2.30±0.44** | 1.11±0.30** |
| Astragalus polysaccharides | 160 | 6.05±1.04**## | 1.25±0.34** |
| Ento-A high dose | 400 | 3.90±1.06##△△ | 1.61±0.48**## |
| Ento-A middle dose | 200 | 3.75±1.01##△△ | 1.50±0.73** |
| Ento-A low dose | 100 | 3.51±0.41##△△ | 1.22±0.32** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model; △△P < 0.01 vs Astragalus polysaccharides | |||
Tab 2结果显示，注射环磷酰胺后，与空白对照组比较，模型对照组的WBC、RBC、PLT、HGB水平均明显降低(P < 0.01);经药物治疗后，与模型对照组比较，各给药组外周血细胞水平均有所升高; Ento-A各组呈一定剂量依赖性，其中WBC、PLT、HGB均已升高或超过正常水平，与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | WBC/×109·L-1 | RBC/×1012·L-1 | PLT/×109·L-1 | HGB/g·L-1 |
| Control | - | 5.08±0.38 | 7.07±0.23 | 582.50±17.95 | 142.28±8.25 |
| Model | - | 2.74±0.33** | 5.98±0.51** | 448.50±24.12** | 106.13±14.85** |
| Astragalus polysaccharides | 160 | 5.88±0.88*## | 6.71±0.31*## | 585.50±56.65## | 134.79±10.05## |
| Ento-A high dose | 400 | 8.02±0.48**##△△ | 6.52±0.23**## | 577.30±89.73## | 138.79±5.08## |
| Ento-A middle dose | 200 | 5.25±1.00##△ | 6.18±0.23**△△ | 561.10±98.95## | 135.80±10.05## |
| Ento-A low dose | 100 | 4.36±0.81*##△△ | 6.06±0.53**△△ | 545.00±32.60## | 133.59±5.50## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs Astragalus polysaccharides | |||||
Tab 3结果显示，模型对照组吞噬能力和吞噬率较正常对照组明显降低(P < 0.01);与模型对照组比较，各给药组吞噬能力和吞噬率均明显提高(P < 0.01);Ento-A各剂量组吞噬能力和吞噬率呈良好的剂量依赖性，其中高剂量组与阳性药黄芪多糖作用相当(P>0.05)。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
Phagocytic ability(OD) |
Phagocytic rate/% |
| Control | - | 0.398±0.061 | 100.10±15.40 |
| Model | - | 0.173±0.037** | 43.56±9.29** |
| Astragalus polysaccharides | 160 | 0.344±0.038*## | 86.53±9.60*## |
| Ento-A high dose | 400 | 0.337±0.059**## | 84.62±14.05**## |
| Ento-A middle dose | 200 | 0.289±0.050**##△△ | 72.68±11.87**##△△ |
| Ento-A low dose | 100 | 0.233±0.026**##△△ | 58.44±6.12**##△△ |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model; △△P < 0.01 vs Astragalus polysaccharides | |||
Tab 4结果显示，模型对照组溶血素生成水平(HC50)较空白对照组明显降低(P < 0.01)，说明成功构建免疫抑制模型。与模型对照组比较，各给药组溶血素生成水平均明显增强(P < 0.01);与黄芪多糖组比较，Ento-A高、中剂量组溶血素生成水平明显提高(P < 0.01)，且HC50呈一定的剂量依赖性。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
Hemolysin level (HC50) |
Proliferation (OD) |
| Control | - | 363.52±3.81 | 0.475±0.067 |
| Model | - | 248.26±16.85** | 0.246±0.028** |
| Astragalus polysaccharides | 160 | 283.96±10.74**## | 0.422±0.040## |
| Ento-A high dose | 400 | 304.12±3.93**##△△ | 0.410±0.041## |
| Ento-A middle dose | 200 | 301.23±6.12**##△ | 0.359±0.069*## |
| Ento-A low dose | 100 | 296.31±1.38**##△ | 0.307±0.012**##△△ |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs Astragalus polysaccharides | |||
与空白对照组比较，模型对照组T淋巴细胞增殖明显降低(P < 0.01);与模型对照组比较，黄芪多糖组及Ento-A高、中、低剂量组T淋巴细胞增殖明显增强(P < 0.01)，其中Ento-A高、中剂量组与黄芪多糖组相当(P>0.05)，高剂量组已基本接近空白对照组(P>0.05)，见Tab 4。
4 讨论免疫反应可分为非特异性免疫反应和特异性免疫反应。非特异性免疫又称固有免疫，并协同、参与特异性免疫反应。特异性免疫反应分为抗体介导的体液免疫和T淋巴细胞介导的细胞免疫。免疫调节是指免疫系统中的免疫细胞、免疫分子及与其它系统之间的相互作用。免疫抑制能引发多种疾病，而免疫调节药物能使得机体的免疫应答维持在正常水平，构建免疫抑制的动物模型可用来评价药物的免疫调节作用[10]。采用注射环磷酰胺造成免疫抑制模型，从非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫3个方面考察Ento-A对小鼠免疫功能的影响。
脾脏和胸腺是重要的免疫器官，脾脏和胸腺的重量可以反映非特异性免疫的功能[11-12]。巨噬细胞是非特异性免疫反应中的重要免疫细胞，在固有免疫中发挥防御功能，也是参与特异性免疫的专职抗原提呈细胞，具有吞噬、杀伤、调控机体免疫等多种功能，是非特异性免疫的指标之一[11-12]。在环磷酰胺作用下，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红细胞的能力明显降低，脾脏指数和胸腺指数均明显降低，固有免疫受到抑制，而给药后，脾脏指数、胸腺指数、吞噬作用呈剂量依赖增加，提示美洲大蠊提取物Ento-A可能有改善免疫抑制小鼠固有免疫的功能。
T淋巴细胞等免疫细胞增殖是机体正常免疫应答的前提与保证，研究T淋巴细胞体外增殖能力是研究细胞免疫的重要手段[13]。在环磷酰胺的作用下，小鼠脾脏T淋巴细胞增殖受到抑制。而给予美洲大蠊提取物Ento-A后，可以明显促进脾脏T淋巴细胞体外增殖，提示Ento-A可以改善免疫抑制小鼠细胞免疫功能。机体外周血细胞数量的变化可反映机体的免疫功能改变，而环磷酰胺不良反应可导致血小板和白细胞的减少[14]。美洲大蠊提取物Ento-A可升高免疫抑制小鼠WBC、RBC、PLT、HGB等血常规指标，提示Ento-A可以改善小鼠免疫功能低下引起的血细胞数量减少。血清溶血素是B淋巴细胞受抗原刺激后产生的抗体，是评价体液免疫的重要指标[11]。Ento-A可以提高免疫抑制小鼠溶血素生成水平，具有提高免疫抑制小鼠体液免疫的功能。
本研究结果提示，美洲大蠊提取物Ento-A对免疫低下小鼠免疫功能具有增强作用，但其具体免疫机制还有待进一步研究。
( 致谢: 本实验在大理大学昆虫生物医药研发重点实验室完成，感谢实验室的老师和同学对实验的指导和帮助。感谢大理大学实验动物中心吴定宇老师，基础医学院研究生常旭、欧红利的支持！)
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