肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，一般由慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-HCC的顺序逐渐演变而来。由于HCC的发病机制尚不明确，目前仍缺少有效的防治措施。HCC的中药治疗是其防治的重要研究方向。丹参是治疗肝纤维化最常用的中药之一，丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是其水溶性提取物之一。通过双盲双模拟临床观察与治疗前后肝组织病理活检，证实Sal B能有效逆转慢性乙型肝炎-肝纤维化[1]。Sal B通过抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，减少胶原纤维的沉积而发挥抗肝纤维化作用。有研究报道，Sal B高浓度可抑制肝癌HepG2细胞的增殖[2]，促进其凋亡[3]。
转化生长因子-β1(transforming grow factor beta 1，TGF-β1)是一种重要的细胞生长和分化调节因子，其介导的TGF-β1/Smad信号转导通路在肝纤维化-HCC的发生、发展中发挥重要作用[4-5]。研究表明，Smad3不同位点磷酸化在HCC的发生发展中发挥不同的效应，其C-末端活化形式pSmad3C，靶向下游基因p21，介导肿瘤抑制信号，而其连接区活化形式pSmad3L，靶向下游基因纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)及c-Myc，介导促纤维化-癌变信号[6]。我们推测，Sal B可能通过干预pSmad3C/pSmad3L而发挥抗肝纤维化-HCC作用。因此，本研究建立二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱导的小鼠肝纤维化-HCC模型，观察Sal B对小鼠肝纤维化-HCC进程的影响，并探讨Sal B经由pSmad3C/p21、pSmad3L/PAI-1/c-Myc信号的调控机制。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂DEN(0.95 kg·L-1)购于美国Sigma公司；Sal B(纯度≥95%, 批号：PS12091001)、秋水仙碱(colchicine，Col)(纯度≥98%，批号：PS08092201)，购自成都普思生物科技股份有限公司。Western blot及IP细胞裂解液、PMSF购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗pSmad3L(linker-phosphorylated Smad3)多克隆抗体由日本关西医科大学松崎教授惠赠；兔抗pSmad3C(C-terminally phosphorylated Smad3)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗PAI-1(PA5-27216)多克隆抗体购自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗c-Myc(ab32072)单克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗p21单克隆抗体(556430)购自BD Biosciences公司；小鼠抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠lgG，均购自北京中杉金桥；苦味酸、品红，购自西陇化工股份有限公司。
1.2 DEN诱导小鼠肝纤维化-HCC模型建立及SalB干预♂昆明系小鼠，体质量(20±2)g，SPF级，安徽医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(皖)2011-002。100只♂小鼠，随机分成5组：正常对照组、模型组、Sal B低剂量(15 mg·kg-1)组、Sal B高剂量(30 mg·kg-1)组、阳性药物Col(0.2 mg·kg-1)组，每组20只。正常对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水，其余组小鼠给予1.0% DEN溶液(无菌生理盐水配置)诱导肝纤维化-HCC模型，按体质量10 mL·kg-1给药，每周1次，连续16周。于造模当天开始，Sal B组小鼠分别给予15、30 mg·kg-1·d-1 Sal B灌胃，阳性药物组小鼠给予0.2 mg·kg-1·d-1 Col灌胃，正常对照组小鼠给予相应溶媒灌胃，持续给药至16周末。于第12周末处死小鼠5只，16周末处死小鼠8只，取材，进行组织固定、病理检测或蛋白表达检测。
1.3 检测指标 1.3.1 一般状况实验过程中定期观察记录小鼠进食状况、体重变化、活动情况及外表征象。
1.3.2 肝脏指数小鼠处死后，切取全部肝脏，生理盐水清洗血迹，滤纸吸干，称取肝脏重量(Wl)、体质量(Wb)，计算肝脏指数(Wl/Wb)×100%。
1.3.3 病理观察切取肝脏左叶，4%多聚甲醛溶液固定48 h，脱水，常规石蜡包埋，4 μm切片，烤片；梯度酒精脱蜡，水化，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。按照标准操作规范，使用数字扫描仪显微镜随机拍摄肝细胞团显微照片5张，由病理医师阅片、诊断和评价，确定肝脏病变程度。
1.3.4 Van Gieson(VG)染色配制VG染液：A液，1%酸性品红水溶液；B液，苦味酸饱和水溶液，临用前按A :B=1 :9的比例混合。石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗，用滤纸吸干水分，VG染液染色5 min左右，95%酒精分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察胶原纤维分布情况。
1.4 Western blot法检测pSmad3C、pSmad3L、p21、PAI-1、c-Myc蛋白表达常规方法提取小鼠肝组织中细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别以小鼠抗GAPDH、兔抗pSmad3C、兔抗pSmad3L、小鼠抗p21、兔抗PAI-1、兔抗c-Myc抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，继而以相应的辣根过氧化物酶标记lgG常温孵育90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法曝光显影。采用Image J软件对Western blot检测结果进行灰度分析，分析结果以目的蛋白与内参蛋白GAPDH条带的比值表示。
1.5 统计学处理计量资料用x±s表示，采用SPSS16.0软件对定量资料进行统计学分析，多组均数之间两两比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 Sal B可改善DEN诱导的肝纤维化-HCC小鼠的一般状况正常组小鼠饮食好，活泼好动，反应灵活，背毛柔顺有光泽，体重明显增加；模型组小鼠在诱癌初期，食欲良好，体重未减轻，12周后，模型组小鼠出现皮毛枯槁无光泽、食欲不振、活动减少等表现，体重逐渐减轻；和模型组比较，Sal B组症状改善，食欲增加，精神状况较好。DEN诱导小鼠肝纤维化-HCC过程中，部分小鼠因耐受能力较差，出现灌药后死亡等，至DEN诱癌第16周取材时统计，各组小鼠死亡率分别为正常对照组(0/20，0.0%)、模型组(7/20，35.0%)、Sal B低剂量组(5/20，25.0%)、Sal B高剂量组(3/20，15.0%)、Col组(6/20，30.0%)。
2.2 Sal B对DEN诱导的肝纤维化期小鼠体质量与肝脏系数的影响与正常组相比，12周末时，模型组小鼠体质量、肝重与肝脏系数明显降低；与模型组比较，Sal B组小鼠体质量与肝重有增加的趋势，肝脏系数无明显变化(Tab 1)。
| Group | Dose/mg • kg-1 | Body weight/g | Liver weight/g | Liver index/% |
| Control | - | 55.0 ±3.406 | 2. 829 ±0.187 | 5.156 ±0.367 |
| Model | - | 27.2±2.638## | 0.851 ±0.188## | 3.103 ±0.445## |
| Sal B | 15 | 28.6 ±3.666 | 0.887±0.172 | 3.080±0.233 |
| Sal B | 30 | 27.4±1.019 | 0.805±0.077 | 2.937±0.265 |
| Co | 0.2 | 27. 8 ±0.980 | 0.889±0.152 | 3.188±0.481 |
| ##P < 0.01 vs control | ||||
Fig 1A小鼠肝脏大体可见，正常组小鼠肝脏表面光滑，边缘锐利，质地柔软；12周末模型组小鼠肝脏表面粗糙，边缘变钝；与模型组比较，Sal B组小鼠肝脏表面较光滑，质地较柔软，症状改善。
|
| Fig 1 Effects of Sal B on hepatic fibrosis induced by DEN in mice (HE, × 100; VG, × 100) A: General appearance of liver; B: HE staining of liver tissue; C: VG staining of liver tissue; D: Protein expression detected by Western blot. 1: Control; 2: Model; 3: Sal B 15 mg·kg-1; 4: Sal B 30 mg·kg-1; 5: Col. ##P<0.01 vs control; *P<0.05, **P<0.01 vs model. |
如Fig 1B、1C所示，第12周时，光镜所见，正常组小鼠肝小叶结构完整，有肝小叶和汇管区，VG阳性胶原纤维仅局限于门管区和小叶间静脉周围；模型组肝组织炎性细胞浸润，胶原纤维增生，大量胶原纤维分隔肝小叶结构形成假小叶结构；Sal B组炎细胞浸润、胶原纤维增生均轻于模型组，未形成假小叶结构。Sal B组小鼠肝组织病变程度减轻。提示第12周为纤维化病变期，Sal B具有抗肝纤维化的作用。
2.5 Sal B对DEN诱导的肝纤维化期小鼠肝组织中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1、p21蛋白表达的影响Fig 1D Western blot结果显示，12周时，正常肝组织中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1蛋白表达均较少，p21蛋白几乎不表达；与正常组相比，模型组肝组织中pSmad3C蛋白无明显变化，p21蛋白表达增多，pSmad3L和PAI-1蛋白表达明显增多；与模型组比较，Sal B组肝组织中pSmad3C、p21蛋白水平明显升高，pSmad3L、PAI-1蛋白水平明显降低。提示Sal B抗小鼠肝纤维化时，升高pSmad3C、p21蛋白，降低pSmad3L和PAI-1蛋白的表达。
2.6 Sal B对DEN诱导的小鼠HCC癌前阶段体质量与肝脏系数的影响16周末时，与正常组相比，模型组小鼠体质量、肝重与肝脏系数明显减少；与模型组比较，Sal B组小鼠体质量、肝重与肝脏系数明显增加, 差异均具有统计学意义(Tab 2)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Body weight/g | Liver weight/g | Liver index/% |
| Contol | - | 53.25 ±4.576 | 2.385 ±0.187 | 4.492±0.336 |
| Model | - | 26.63 ±2.342## | 0.866 ±0.142## | 3.241 ±0.385## |
| SalB | 15 | 29.50 ±2.646* | 1.155 ±0.290* | 3.869 ±0.643* |
| Sal B | 30 | 28.25 ±1.920 | 1.103 ±0.232* | 3.881 ±0.650* |
| Co | 0.2 | 29.71 ±2.249 | 1.193 ±0.217* | 4.015 ±0.642* |
| ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model | ||||
由小鼠肝脏大体所见，正常组小鼠肝脏表面光滑，边缘锐利，质地柔软；16周末，模型组肝脏表面粗糙，出现大量弥漫性结节，质地坚硬；与模型组比较，Sal B组小鼠肝脏结节少，质地柔软，症状改善(Fig 2A)。
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| Fig 2 Effects of Sal B on precancerous lesion of hepatocellular carcinoma induced by DEN in mice (HE, × 100) A: General appearance of liver; B: HE staining of of liver tissue; C: Protein expression detected by Western blot. 1: Control; 2: Model; 3: Sal B 15 mg·kg-1; 4: Sal B 30 mg·kg-1; 5: Col. ##P<0.01 vs control; *P<0.05, **P<0.01 vs model. |
如Fig 2B所示，16周时光镜下所见，正常组肝组织细胞围绕中央静脉呈放射状有序排列，相邻肝板吻合连接成网状，肝细胞核圆，位于细胞中央，着色较浅，肝细胞无明显变性与坏死；模型组肝小叶结构紊乱，肝细胞坏死发生在肝小叶内、累及肝细胞点状坏死，坏死灶原有细胞消失，代以浸润的淋巴细胞。增生肝细胞具有癌细胞样异型性，表现为细胞体积变大，且大小不一致，同时，肝细胞核体积变大，染色变深，分裂相增多；Sal B组肝细胞坏死、炎细胞浸润、纤维组织增生、细胞核异型性均轻于模型组。提示16周为癌前病变期。12周、16周Sal B组小鼠肝组织病变程度均明显减轻。Sal B延缓DEN诱导的小鼠肝纤维化-HCC进程。
2.9 Sal B对DEN诱导的HCC癌前病变期小鼠肝组织中pSmad3C、pSmad3L、c-Myc、PAI-1、p21蛋白表达的影响Fig 2C Western blot结果显示，16周末，正常肝组织中pSmad3C、pSmad3L、PAI-1表达均较少，c-Myc、p21蛋白几乎不表达；与正常组相比，模型组肝组织中pSmad3C、P21蛋白表达增多，pSmad3L、c-Myc、PAI-1蛋白表达明显增多；与模型组比较，Sal B组肝组织中pSmad3C蛋白水平明显升高，p21蛋白水平几乎无变化，pSmad3L、c-Myc、PAI-1蛋白水平明显降低。提示Sal B延缓小鼠肝纤维化-HCC进程时，升高pSmad3C蛋白水平，降低pSmad3L、PAI-1、c-Myc蛋白的表达。
3 讨论DEN作为N-亚硝基类物质的一种，是遗传毒性致癌物，其诱导HCC发生，一般经过慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-癌前病变-HCC等病变过程，与人类肝癌发病进程相似[7]。小鼠具有可基因干预发现靶点的优势，DEN诱发小鼠肝脏癌前病变被用于预防肝癌药物筛选的理想动物模型[8-9]。本实验采用DEN腹腔注射给药，实验结果表明，DEN能够成功诱导小鼠肝纤维化、肝脏癌前病变模型。小鼠出现一般状态不良、体质量与肝脏重量降低、肝系数下降，炎细胞浸润、肝细胞变性、胶原纤维增生，12周末出现假小叶结构，16周末增生肝细胞核异型性明显，分别具备肝纤维化、HCC癌前病变的基本特征。
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参的根，其味苦，微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛的功效。近年来，丹参、丹参复方制剂及丹参有效成分在慢性肝病治疗，尤其是抗肝纤维化中得到广泛应用，其中丹参有效成分研究进展迅速。Sal B是丹参中含量最高的活性成分[10]，也是水溶性成分中研究最多的成分之一。Sal B可抑制和减轻四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)、二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)、TGF-β1诱导的大鼠肝纤维化。临床试验也显示，Sal B可明显逆转乙肝患者的肝纤维化。本次实验中，DEN诱导的小鼠肝纤维化阶段，与模型组比较，Sal B组炎性细胞浸润，纤维增生明显减轻。DEN诱导的小鼠肝癌癌前阶段，Sal B组小鼠体质量、肝重、肝脏系数明显增加，肝细胞坏死、细胞异型性均轻于模型组。表明Sal B具有抗DEN诱导小鼠肝纤维化-HCC的作用，可以延缓小鼠肝纤维化-HCC疾病进程，对小鼠肝纤维化和肝癌前病变具有防治作用。
体内外实验表明，Sal B抗肝纤维化作用可能与TGF-β1/Smad信号转导通路有关。Sal B可抑制HSC中TGF-β1表达及其激酶的活性，抑制胞内Smad2、Smad3的表达，Smad2的磷酸化及核转位[11-12]。近年研究表明，TGF-β1/Smad信号转导通路在HCC的发生、发展过程中具有双重作用。目前认为，这种双重作用与Smad3的C末端和L区磷酸化有关。在肝纤维化过程中，TGF-β1一方面通过TGF-β1/TβRI/pSmad3C/p21抑制肝纤维化的发生；另一方面，通过TGF-β1/MAPK/pSmad3L/PAI-1使得Smad3连接区磷酸化[13-14]，促进胶原等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成，同时促进下游靶基因PAI-1表达增强，抑制ECM降解，导致ECM过度堆积。本实验结果表明，正常小鼠肝脏中pSmad3C/p21与pSmad3L、PAI-1蛋白表达均较少，DEN组中pSmad3C p21表达无明显变化，pSmad3L和PAI-1表达明显增多，Sal B组pSmad3C与p21表达明显多于DEN组，pSmad3L和PAI-1表达明显少于DEN组。因此，Sal B可能一方面通过TGF-β1/TβRI，促进pSmad3C表达，进而激活其下游p21蛋白表达，抑制肝纤维化。同时，通过TGF-β1/JNK通路下调pSmad3L及其下游靶基因PAI-1的表达，减少肝组织中ECM的合成，进而延缓肝纤维化。
在HCC癌前阶段，TGF-β1与Ⅰ型受体结合，促使Smad3C磷酸化，pSmad3C促使p21表达增多，传递肿瘤抑制信号。p21抑制受损DNA的复制和积累，从而抑制细胞的生长和分裂，促进细胞凋亡。炎症因子激活JNK通路，促进pSmad3L表达，进而激活癌基因c-Myc表达，促使细胞增殖异常、细胞浸润而发生癌变，同时诱导PAI-1表达增多，促进肿瘤细胞浸润、转移，活化间充质细胞的ECM合成传递致瘤信号[15-16]。本实验结果表明，正常小鼠肝脏中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1、c-Myc蛋白表达均较少，DEN组pSmad3C表达无明显变化，p21、pSmad3L、PAI-1、c-Myc表达明显增多，Sal B组pSmad3L、PAI-1、c-Myc表达明显少于DEN组，pSmad3C表达多于DEN组，p21表达无明显变化。因此，Sal B的抗HCC作用可能主要通过抑制pSmad3L的表达，进而抑制其下游靶基因c-Myc和PAI-1表达，来阻碍HCC的发生发展。
综上，DEN诱导肝纤维化-HCC进程中，Sal B可能通过增强pSmad3C/p21介导的抑癌信号而减弱pSmad3L/PAI-1/c-Myc介导的促纤维化-癌变信号，阻碍肝纤维化-肝癌进程。
( 致谢: 本实验病理检测部分得到安徽省立医院病理科郭真理医师指导分析，在此由衷地表示感谢。)
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